Q/LB.□XXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國熱帶作物學會提出并歸口。本文件起草單位：廣西大學、農業農村部農技推廣技術中心、廣東農科院、廣西農科院本文件主要起草人：張木清、姚偉、許譽芝、暴怡雪、史夢雅、陳保善、姚姿婷、鄒承武、徐世強、王繼華、王澤平、胡琴、黃江峰、肖勝華、余凡、張積森、蔣洪濤、林鎮越、黃振、張桂英甘蔗梢腐病抗性評價技術規范范圍本文件規定了甘蔗梢腐病抗性鑒定的術語和定義、田間鑒定和試驗設計、室內苗期鑒定和試驗設定、病情調查、抗病性評價以及鑒定記載表格。本文件適用于我國非主要農作物品種登記中甘蔗品種梢腐病抗性鑒定和抗性評價。本文件同時適用于我國甘蔗品種區域試驗、生產試驗和自然誘發鑒定中的甘蔗梢腐病的病情調查和抗性評價；適用于甘蔗品種、品系及種質資源對甘蔗梢腐病抗性的田間鑒定和室內鑒定。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1784-2009農作物品種試驗技術規程甘蔗NY/T3925-2021農作物品種試驗規范糖料作物術語和定義下列術語和定義適用于本部分3.1甘蔗梢腐?。≒okkahboengdisease）甘蔗梢腐病主要是由鐮刀菌復合種（Fusariumspeciescomplex）引起的，該病主要發生在梢頭的嫩葉部位，感病梢頭部位葉片扭纏在一起，嚴重時會出現梢頭生長點腐爛，幼嫩心葉壞死，甚至整株枯死。3.2田間評價（Fieldevaluation）通過對田間種植甘蔗并在特定時期進行田間調查評價。3.3病原分離物（Pathogenicisolate）采用人工分離培養的方法，從病健交界處分離獲得病原物的純培養物。3.4鑒別寄主（Diagnostichost）用于鑒定病原物的甘蔗品種、品系材料。3.5致病性（Pathogenicity）病原物具有破壞寄主植物引起病變的能力。3.6培養基（Medium）可用于培養病原物的人工配制基質。3.7接種體（Inoculum）用于接種可以引起病害的病原物。3.8接種懸浮液（Inoculumsuspension）用于接種的含有定量接種體的液體。3.9自然發病(Naturalinfection)在未經人工接種情況下發病。3.10人工接種（Artificialinoculation）在適宜條件下，通過人工操作將接種體置于植物體的適當部位并使之發病的過程。3.11發病率（發病程度）（Diseaseincidence）發病率（或者普遍率）是指發病的普遍程度，用發病株樹占調查總株數的百分率。3.12病情級別（Diseaseratingscale）人為定量植物個體或群體發病程度的數值化描述。3.13病害指數（Diseaseindex)通過對植株個體發病程度（病情級別）數值的計算所獲得的群體發病程度的數值化描述形式。3.14抗病性（Diseaseresistance）植物體所具有的能夠減輕或克服病原物致病作用的可遺傳形狀。3.15抗病性鑒定（Diseaseresistanceidentification）通過適宜技術方法鑒定植物對特定病害的抵抗水平。3.16抗性評價（Evaluationfordiseaseresistance）根據采用的技術標準判別植物對特定病害反應的程度和抵抗水平的描述。4病原物4.1病原物來源從我國甘蔗梢腐病的發病菌源地采集，或者我國甘蔗主產區不同生態區采集病株，經分離、純化、分子鑒定后，藤倉鐮孢菌種復合體（FusariumfujikuroiComplex，FFC）的四個種：甘蔗鐮孢菌（F.sacchari，Fs）、層出鐮孢菌（F.proliferatum,Fp）、輪枝鐮孢菌（F.verticillioides,Fv）和新知鐮孢菌（F.andiyazi,Fa）組成梢腐病菌的菌種庫。其中甘蔗鐮孢菌是我國梢腐病的優勢種，新知鐮孢菌主要集中在云南，層出鐮孢菌主要集中在冷涼地區和季節（冬季）。4.2接種體組成從我國甘蔗梢腐病的發病菌源地采集并經分離、純化和鑒定后的甘蔗鐮孢菌（F.sacchari，Fs）、層出鐮孢菌（F.proliferatum,Fp）、輪枝鐮孢菌（F.verticillioides,Fv）和新知鐮孢菌（F.andiyazi,Fa）的優勢種單獨接種或者混合接種。也可以根據委托單位要求從菌種庫中制備。沒有特定要求的情況下，接種體為菌種庫中最新的病原分離物。4.3.病原物分離和確定從發病植株葉片的典型病斑上進行分離純化，形態學、分子和致病性鑒定確認為藤倉鐮孢菌種復合體（FusariumfujikuroiComplex，FFC）的一種：甘蔗鐮孢菌（F.sacchari，Fs）、層出鐮孢菌（F.proliferatum,Fp）、輪枝鐮孢菌（F.verticillioides,Fv）和新知鐮孢菌（F.andiyazi,Fa）。4.4甘蔗梢腐病病原菌的繁殖和保存4.4.1甘蔗梢腐病病原菌的繁殖將保存的菌株接種于直徑為90mm、含有20mL經高壓滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）平板培養基上進行活化，28℃下黑暗培養2-3d，在無菌條件下挑取新活化的菌株邊緣菌絲接種到滅菌的馬鈴薯葡萄糖液體（PDW）培養基中，28℃，220r/min搖床震蕩暗培養5-7d，將菌液用四層紗布過濾去除大部分菌絲，過濾后的菌液在4000rpm下離心10min，去除廢液，收集菌體，用少量無菌水將孢子重懸。用無菌水將孢子濃度稀釋至約1×106cfu/mL，用于接種。4.4.2甘蔗梢腐病病原菌的采集和保存梢腐病病原菌采集可在采菌操作臺中用玻璃罩法進行，也可用孢子收集吸器采集。采集的梢腐病病原菌先用冷凍干燥器處理后裝安培管中密封，置于液氮罐或超低溫冰箱中進行長期保存?；蛘呤占糠志w于2ml凍存管中，加入1ml的50%甘油于-80℃下保存。5鑒定5.1室內苗期抗性鑒定5.1.1苗期抗性鑒定在溫室中進行，溫室溫度控制在25-30℃之間，自然光照。將待測品種（系）和感病對照播種于60cm×40cm×15cm的塑料方盒內，每品種（系）30個單芽種植一盆，播后給塑料盒套上用鐵絲架撐開的透明塑料袋以防污染，置于溫室培養，幼苗長至4-5葉期進行針刺法接種。使用無菌接種注射器吸取加入適量吐溫20的100μl孢子懸浮液（1×106cfu/mL）在幼苗基部葉鞘0.5-1cm處進行注射接種，3-5個重復，接種實驗在傍晚進行。接種后置于溫室培養7-10d，隨后開始第一次發病情況跟蹤調查，此后每24h調查一次，記錄新葉的發病情況。5.1.2離體葉段法抗性鑒定取田間生長健康的待測品種（系）、對照的感病和抗病品種葉片，超凈臺上剪取6.8cm整齊對稱無裂痕葉段，每品種（系）剪3個葉片，75%酒精消毒。用消毒后的剪刀蘸取事先繁殖的選定菌株的孢子懸浮液在葉脈一側剪開1cm切口，對應的葉片另一側用無菌水剪開作為對照，置于含有三層消毒濕潤濾紙的直徑為90mm的培養皿中，25-30℃（±1℃）光照培養箱中培養（16h光照，8h黑暗），3-5個重復，接種24h后開始連續跟蹤調查，記載切口處的受害情況。5.2田間鑒定5.2.1田間鑒定圃田間鑒定圃設置在甘蔗梢腐病人工營造抗性鑒定圃或病害常發區域。田間鑒定病圃的栽培條件（品種、土壤類型及施肥）須均勻一致，且符合科學的農業實踐（GAP），設立保護區?；诖瞬『Πl病特點，在田間管理上要保持高濕度、多灌水、高氮肥（最好施用氨態氮化肥，如硫酸銨、碳酸氫銨），營造易發病的環境。5.2.2鑒定設計采取隨機區組設計，3次重復，4-5行/區，行長7-10m，行距1.0-1.2m，小區面積33.5-50.0m2。甘蔗以春植蔗（2-3月）種植為佳。5.2.3鑒定對照材料利用已知抗性的標準參考品種，將待測無性系抗性與其相比較，詳見表1。表1甘蔗梢腐病抗性參考品種抗性等級參考品種高抗（HR）桂柳05-136,新臺糖4,海蔗28抗（R）新臺糖22,新臺糖23,中糖12-02中抗（MR）CP89-2143,CP94-1100,新臺糖26感（S）NCo310,CP81-1254,新臺糖25高感（HS）中蔗9,Co1001,CP94-13405.2.4調查時間病害調查時間為6-9月份。5.2.5調查方法每小區調查中間2行，用目測法評估葉片和蔗莖的發病程度，記錄調查的總株數、病株數及病級。6病害調查6.1調查時期和方法在甘蔗伸長初期（6月）、中期（7月）和盛期（8月）各調查一次；調查時目測每份鑒定品種群體的發病狀況，調查發病率，根據6.5病情級別劃分標準對調查材料逐株進行調查并記載病情級別（發病率及嚴重度）。6.2最高病情級別個體確認每個品種（系）取三次調查結果的最大值。根據病害癥狀描述，逐份材料進行調查并記載病情級別。如每個重復最高病情級別植株只有少數幾株，則需要對該株甘蔗主要特征特性與本品種典型特征特性進行比較，在確認符合本品種典型性后，該株甘蔗所表現的病情級別就作為劃分該品種（材料）抗性類別的主要依據。如該株甘蔗不符合本品種典型性，則不記載病情。按上述規定逐株向下確認，直至某病情級別被確認為止。6.3鑒定調查記載表需要鑒定人員和復核人員簽字在開展鑒定調查時，鑒定人員與復核人員一同進行，鑒定人員對鑒定植株病情級別進行判斷，經復核人員簽字確認后進行記錄。6.4抗性分離記載若鑒定群體中出現明顯的抗、感類型，應在調查表中注明“抗性分離”，用/表示。6.5病情級別劃分標準甘蔗梢腐病田間調查和離體鑒定分級標準詳見表2和表3。表2甘蔗梢腐病田間調查分級標準發病等級發病癥狀0無癥狀11~2張葉片有癥狀，即葉片基部或其他部分褪綠；輕微皺縮呈波紋狀；有少許紅褐色斑點或條紋。23~4張葉片有以下癥狀，即心葉皺縮呈階梯狀，顯著黃化、扭曲、糾纏且有紅褐色條紋；葉片纏繞扭曲或缺刻，出現褐色病斑。34張葉片以上有以上癥狀，或多片葉明顯褶皺、扭曲、纏繞，有明顯的紅褐色條病斑，葉子變短并呈匕首狀，生長受阻，但蔗株尚未出現頂腐4心葉和生長點腐爛死亡，梢部幼嫩組織形成頂腐狀，整個頂端死亡或長出側芽表3甘蔗梢腐病離體鑒定分級標準發病等級發病癥狀0基本無癥狀1葉片剪接處出現輕微褪綠癥狀2葉片出現褪綠黃化病斑，蔓延約為1cm左右3葉片褪綠黃化面積迅速加大，并出現明顯的紅褐色條病斑4整個葉片幾乎均為紅褐色條病斑，出現腐爛現象6.6病情記載及病情指數調查記錄每一鑒定的植株的病情級別，并計算病害嚴重等級。病情指數按公式計算：DI=S為劃分的等級數；N為調查的甘蔗株數；n為各級病株數；s為該病級值；7抗病性評價7.1抗性類別劃分標準7.1.1田間抗病類別依據鑒定材料多年多次的最高發病率和病情指數確定抗性水平，劃分標準見表4。表4甘蔗梢腐病田間抗性評價標準發病等級發病率（%）發病指數抗性類別00-10.00-5.0高抗（HR）110-20.05-10.0抗（R）220-35.010-15.0中抗（MR）335-45.015-25.0感（S）4﹥45.0﹥25.0高感（HS）7.1.2室內抗性類別依據苗期針刺法接種，新葉的發病程度確定抗性水平，劃分標準見表5。表5苗期針刺法抗性鑒定標準抗性類別發病程度抗性類別0基本無癥狀高抗（HR）1針刺部位輕微皺縮呈波紋狀，有少許紅褐色斑點抗（R）2傷口處出現顯著褪綠黃化和扭曲，葉片出現褐色病斑中抗（MR）3葉片受害面積加大，出現明顯褶皺、扭曲、纏繞，有明顯的紅褐色條病斑感（S）4心葉和生長點腐爛，直至蔗株死亡高感（HS）依據葉片離體鑒定，切口處葉片的病害擴展程度確定抗性水平，劃分標準見表6。表6離體鑒定法抗性鑒定標準抗性類別發病程度抗性類別0基本無癥狀高抗（HR）1剪接處出現輕微退綠抗（R）2葉片出現退綠黃化病斑，并小范圍蔓延中抗（MR）3葉片受害面積迅速加大，出現明顯的紅褐色條病斑感（S）4整個葉片幾乎均為紅褐色條病斑，且出現腐爛高感（HS）7.2有效性判別對照感病品種或任一鑒定品種的抗性級別達到高感級別（4），該批次鑒定有效。7.3重復鑒定參考鑒定品種的抗性級別，同一鑒定品種的抗性級別一年為感（3），另一年在抗或者高抗，如果兩年抗性級別相差2個級別以上（包括2個級別），需要做第三次抗性鑒定；或一年在高感（4），另一年在抗或高抗，需要做第三次抗性鑒定。7.4抗性評價7.4.1在3年（次）鑒定結果中，如有2年的抗性類別是一致的，則此抗性類別作為最終鑒定結論。7.4.2達到高抗-抗或感-高感類別的鑒定品種，當兩年抗性類別不一致時，以記載的被確認的最高病情級別所對應的抗性類別為準。7.4.3參考感病鑒定品種，人工接種同一鑒定品種，若兩年抗性級別相差1個等級，取抗性級數值別較大的鑒定結果，對照7.1標準重新劃分抗性類別；若兩年抗性級別相差2個級別以上（包括2個級別）的，則需要做第三次抗性鑒定，取位于中間的抗性級別，重新劃分抗性類別。8鑒定報告8.1人工接種鑒定一般以鑒定品種對特定生態區內優勢種或不同產區優勢種的混合接種體的反應出具鑒定報告。鑒定報告一般單個品種單獨出具，如集中批量送樣的，也可以多個品種出具一份報告。8.2鑒定報告要蓋鑒定單位公章，要有制表人、復核人和簽發人簽字。

附錄A（資料性）A.1甘蔗梢腐病病原菌1.1學名和形態描述甘蔗梢腐病病原菌為藤倉鐮孢菌種復合體（FusariumfujikuroiComplex，FFC）的四個不同種：甘蔗鐮孢菌（F.sacchari，Fs）、層出鐮孢菌（F.proliferatum，Fp）、輪枝鐮孢菌（F.verticillioides，Fv）和新知鐮孢菌（F.andiyazi，Fa）。其形態特征大體相似，表現為菌絲絮凝豐富，具有不規則邊緣，隨時間推移菌絲顏色從白色到淡紫色不等，大分生孢子通常有3~5個分隔，較細，呈鐮刀狀，壁?。恍》稚咦映拾魻罨蚵亚蛐?，基部扁平，通常為0~1個隔膜；獨有特征表現為：甘蔗鐮刀菌（Fs）分生孢子由多個假頭組成，唯有新知鐮刀菌（Fa）含有假厚垣孢子（類似于厚垣孢子，但有一個光滑的、更薄的壁），層出鐮刀菌（Fp）分生孢子鏈通常短于輪枝鐮刀菌，輪枝鐮刀菌（Fv）產生的分生孢子座以“v”形成對出現，呈“兔耳”狀（圖1）。單位為μm圖1甘蔗鐮孢菌（Fs）、新知鐮孢菌（Fa）、層出鐮孢菌（Fp）和輪枝鐮孢菌（Fv）的菌落形態和分生孢子形態特征1.2病原菌鑒定方法1.2.1分離病原菌取病健交界處（病斑與健康部分的交界處）的甘蔗葉片，剪成邊長為0.3-1.5cm大小的長方形葉片，在超凈工作臺中，將葉片置于0.1%的升汞水溶液中洗滌表面雜質，30s后取出放入70%的酒精水溶液中攪拌洗滌30s，無菌水洗2-3次去除表面殘留的升汞和酒精，反復三次。用鑷子將3-5片葉片接種于含100μg/mL氨芐青霉素的PDA培養基上，28℃倒置暗培養3-4d。1.2.2培養純化待菌落長出后，挑取不同形態特征的菌落進行劃線純化培養，28℃倒置培養2-3天后，純化3-4代。1.2.3單胞分離無菌操作條件下，接種環挑取純化后的單菌落邊緣菌絲置于1mL無菌水，按10倍濃度梯度稀釋2-3次，隨后用移液槍吸取10-20μL菌液均勻涂布在PDA培養基上，28℃倒置暗培養2-3d，挑取單菌落邊緣菌絲接至PDW培養基中，28℃200r/min搖床培養3-4d。1.2.4菌株保存及病原菌基因組DNA提取無菌操作條件下，吸取帶菌絲的菌液300~500μL于2ml凍存管中，加入等體積50%的甘油混勻，封口膜密封并編號，置于-80℃冷凍保存。基因組DNA使用真菌基因組試劑盒提取。1.2.5PCR鑒定以基因組DNA為模板，利用真菌特異引物ITS1/ITS4和EF1/EF2進行PCR鑒定（ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS45’-TCCTCCGCTTA