任務六抗原抗體的制備主要內容單元一抗原的制備單元二抗血清的制備單元三單克隆抗體的制備單元四基因工程抗體學習目標單元一抗原的制備抗原〔免疫原〕：免疫原〔immunogen)指用于制備抗體的抗原(antigen)或半抗原(hapten〕?？乖w粒性抗原可溶性抗原蛋白質抗原多糖抗原核酸抗原一、顆粒性抗原的制備顆粒性抗原細胞性抗原：血細胞和組織細胞病原體：細菌、病毒、支原體、寄生蟲等采集靜脈血玻璃珠脫纖維離心、洗滌調適宜濃度〔一〕綿羊紅細胞的制備(二)細菌抗原的制備用途:(1)作為診斷菌液。(2)用于制備免疫血清或診斷血清。1.制備方法培養細菌別離、鑒定擴大培養適宜濃度滅活處理離心、洗滌2.細菌抗原的檢定1.一般性狀檢定菌種典型；抗原為乳白色懸液；鹽水中不自凝。2.無菌試驗甲醛處理后37℃培養2-3d無菌生長3.純度檢查革蘭氏染色鏡檢10個視野無雜菌。4.特異性試驗玻片凝集試驗強陽性。5.定量凝集試驗凝集效價不低于原血清凝集效價的50%6.濃度測定。二、可溶性抗原的制備組織細胞粗抗原制備----組織、細胞清洗和去污處理細胞裂解〔搗碎方法〕勻漿物提取〔初篩物〕可溶性抗原制備----勻漿物中目的抗原提取純化〔不同純化方法，屢次純化〕鑒定〔定性、定量、特異性、理化性等〕分裝、保存可溶性抗原制備的一般流程二、可溶性抗原的制備〔一〕材料的選取與預處理〔二〕細胞裂解〔三〕純化抗原的提取〔四〕抗原的鑒定〔五〕抗原的濃縮與保存五步驟〔一〕材料的選取與預處理組織：新鮮或低溫保存〔-40℃〕處理方法：〔1〕器官或組織剪去包膜、結締組織及大血管，生理鹽水或緩沖液洗去殘留血液和污物，剪成小塊，再搗碎?！?〕細胞緩沖液混懸后離心，再進行裂解或搗碎。二、細胞裂解1.細胞勻漿〔1〕高速組織勻漿器法〔2〕研磨法：玻璃勻漿器2.超聲波破碎法適用范圍：組織細胞和微生物細胞。機制：可能與強聲波作用于溶液時，氣泡產生、長大和破碎的空化現象有關，空化現象引起的沖擊波和剪刀力使細胞裂解。超聲破碎的效率取決于聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度和細胞的類型。特別注意：使用時注意降溫、防止過熱，防止產生氣泡。3.酶處理法適用范圍：多種微生物細胞機制：利用酶反響，破會細胞壁上特殊的鍵，從而到達破壞細胞壁的目的。優缺點：優點：專一性強，酶解條件溫和。缺點：費用較高。應用做多的是：溶菌酶〔專一分解細胞壁上糖蛋白分子的α-1，4-糖苷鍵〕。4.反復凍融法適用范圍：培養細胞、細胞壁較脆弱的菌體機制：突然冷凍時細胞內冰晶的形成及胞內外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。優缺點：優點：簡便

缺點：①破碎率低②引起對凍融敏感的蛋白質變性5.外表活性劑處理法適用范圍：細菌和培養細胞機制：適當條件下〔溫度、pH、低離子強度〕，外表離子活性劑與脂蛋白形成微泡，使細胞膜通透性改變。優點：作用溫和最常用的是：SDS，Tween〔三〕可溶性抗原純化1.蛋白質抗原的純化純化方法：〔1〕超速離心法別離亞細胞成分和大分子蛋白質〔2〕選擇性沉淀法鹽析法最為經典〔3〕凝膠過濾法〔4〕離子交換層析法〔5〕親和層析法〔1〕超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內，到達彼此別離的目的。特點：用超速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分別離出來。應用：用于少局部大分子抗原和一些比較輕的抗原物質的別離，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。〔2〕選擇性沉淀法原理：根據各蛋白質理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質抗原成分沉淀，從而到達純化的目的。常用方法：鹽析沉淀法〔不同鹽濃度那么溶解度不同〕；常用33～50％飽和度的硫酸銨。特點：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。應用：在大量制備中先用此法粗提，再純化?！?〕凝膠過濾法原理：凝膠具有三維空間多孔網狀結構的物質，經適當溶液平衡后，裝入層析柱。當含有各種分子大小不一的混合物加在凝膠床面時，大分子物質不能進入凝膠顆粒的網孔結構內，在凝膠顆粒之間的空隙中很快地通過凝膠床，短時間內被洗脫出來；而分子較小的物質那么進入凝膠網孔結構內，反復受到阻滯，洗脫較慢。分成大、中、小三種類型。〔4〕離子交換層析法原理：利用帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質抗原。各種蛋白質的等電點不同，所帶電荷不同，與纖維素結合的能力有差異。當梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強度，使參加的離子與蛋白質競爭纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個局部而被洗脫下來，到達別離純化的目的。〔5〕親和層析法2.核酸抗原的制備主要步驟破碎細胞蛋白質的去除核酸的沉淀酚和氯仿乙醇核酸的保存〔1〕溫度-70℃長期保存-20℃4℃〔5℃〕最正確和最簡單〔2〕介質TE緩沖液〔最常用〕3.脂多糖抗原的制備4.Ig片段的制備〔1〕非共價鍵解離法肽鏈亞單位之間以氫鍵、靜電引力等非共價鍵結合，這些鍵結合力較弱，可經2種方法將其斷開制備片段。①改變pH：蛋白質解離的臨界值為pH3～4(羧基滴定范圍)和pH9～10(賴氨酸—酪氨酸滴定范圍)，當參加酸或堿使pH低于，3或高于10時，肽鏈亞單位就會解離；②利用強變性劑：多數蛋白在8mol／L脲或6moI兒鹽酸胍中會發生變性，使肽鏈亞單位解離，此法也可用于載脂蛋白抗原的解離和膠原肽的提取?！?〕酶解法酶解法的專一性極好，不同的片段可用不同的酶進行裂解。如木瓜酶水解IgG可獲得1個Fc段和2個Fab段；胃蛋白酶水解IgG可獲得F(ab')：和數個小片段。用木瓜酶水解得到的Fc段常作為抗原來制備抗重鏈血清，胃蛋白酶水解得到的F(ab')；常作為抗體試劑應用。〔四〕純化抗原的鑒定、濃縮與保存三、半抗原的制備2.多肽聚合物人工合成的載體。常用多聚賴氨酸(polylysine)，其分子量高達lOOkD以上，是良好的載體。這種多肽聚合物與半抗原結合后，可誘導產生高效價、高親合力的抗體。3.大分子聚合物羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidonc，PVP)等大分子聚合物均可與半抗原結合，參加弗氏完全佐劑可誘導動物產生良好的抗體?！捕嘲肟乖c載體的連接方法1.物理法通過吸附作用。2.化學法通過交聯實現?！踩嘲肟乖蔫b定1.目的：測定半抗原與載體的比例。2.測定方法：〔1〕吸收光譜分析法〔2〕放射性核素標記半抗原摻入法〔1〕如果半抗原有適宜的吸收光譜，測定在一定波長下復合抗原和載體之間克分子吸光度的差異，然后把這個差異與同樣波長下半抗原的克分子吸光度數相比較，就可以準確地計算出所結合的半抗原分子數?！?〕在偶聯反響液中參加一定量的放射性核素標記的半抗原，偶聯反響后經充分透析，測量透析袋中的放射性含量，計算結合到載體上的半抗原分子數。四、免疫佐劑免疫佐劑〔佐劑〕：先于抗原或與抗原同時注入體內，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答類型的物質被稱為免疫佐劑，簡稱佐劑。本質：佐劑可視為一種非特異性免疫增強劑，可增強體液免疫和細胞免疫應答?！惨弧匙魟┑姆N類與制備1.種類具備免疫原性的佐劑：如卡介苗、枯草分枝桿菌、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌、脂多糖、細胞因子等。不具備免疫原性的佐劑：如氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁、磷酸鈣、石蠟油、羊毛脂、外表活性劑、藻酸鈣、多聚核苷酸、胞壁肽等。應用最多的是福氏佐劑、細胞因子佐劑?！?〕福氏佐劑：分完全福氏佐劑〔石蠟油+羊毛脂+卡介苗〕、不完全福氏佐劑〔石蠟油+羊毛脂〕兩種。福氏完全佐劑可提高佐劑效能，但注射后易產生局部持久性潰瘍和肉芽腫，宜注意?！?〕細胞因子佐劑：細胞因子佐劑與抗原合用，可有效激發機體的免疫功能。IL-2、IL-1、IFNγ、IL-12、GM-CSF皆較常應用；細胞因子佐劑還被廣泛應用于腫瘤基因治療中。用于人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、polyI∶C、胞壁酰二肽、細胞因子、熱休克蛋白常用于動物實驗的佐劑：弗氏佐劑(Freund’sadjuvant)。2.制備制備方法〔1〕研磨法〔2〕攪拌混合法〔注射器混合法〕〔3〕其他方法超聲〔二〕佐劑的作用機制1.改變抗原的物理性狀，延緩抗