蛋白質組學及其在醫學研究中的應用

一、概述最早于1994年由澳大利亞一位博士后Wilkins提出,指的是“一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質。”整體性、動態性和系統性RepresentationofaeukaryoticCell

定義：蛋白質組學(proteomics),就是從整體的角度,分析細胞內動態變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態,了解蛋白質之間的相互作用與聯系,揭示蛋白質功能與細胞生命活動規律的一個新的研究領域。Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.二、蛋白質研究的簡要史1975年雙向凝膠電泳技術1986年第一個蛋白質序列數據庫-SWISSPROT1997年

出版了第一部蛋白質組學的專著

2000年3月首次發表了一個生物體的完整蛋白質組2001年6月和2001年2月公布了人類基因組框架圖和序列圖譜

三、蛋白質組學的研究內容組成蛋白質組:一個細胞或組織或機體中所有蛋白質的時空表達狀況的分析

功能蛋白質組:蛋白質的細胞定位、蛋白酶的活性、蛋白質與蛋白質相互作用的連鎖關系及其由此實現的信號傳遞與調控作用四、蛋白質組研究的主要技術方法1.樣品處理方法

（1）色譜（2）亞細胞分級

（3）激光解剖單細胞水平樣品制備

（4）電荷分級與親和分級（5）變性劑及表面活性劑的作用

2.二維凝膠電泳技術(2DE)

又稱雙向電泳,是蛋白質組學研究中的核心技術之一,是目前常用的唯一一種能夠連續地在一塊膠上分離數千種蛋白質的方法完整的雙向凝膠電泳分析,包括樣品制備、等電聚焦、平衡轉移、SDSPAGE斑點染色、圖像捕捉和圖譜分析等步驟

Figure3.Silverstained2-Dgelsfromtissuesamplesofrabbithearts.

⑴基本技術

原理:是在相互垂直的兩個方向上,分別基于蛋白質不同的等電點和分子量,運用等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE),把復雜的蛋白質混合物中的蛋白在二維平面上分離展開。第一向等電聚焦中使用IPG干膠條,將蛋白質成分按其等電點經分離后均勻地分布于不同的pH梯度。第一向分離后將膠條經平衡液平衡后轉移至第二向SDSPAGE中進行。（3）檢測方法

幾個關鍵因素:靈敏度(檢測限),線性范圍,穩定性和重復性常用的檢測方法主要有以下種：有機染料（最常用的是考馬斯亮藍）、銀染（最常用的是堿性/二氨合銀法和酸性/硝酸銀法）、負染、膠體擴散染料、有機熒光團染料、金屬螯合染料

（4）凝膠分離蛋白質的回收

常用的方法包括:直接提取,電洗脫,電印跡至膜上,凝膠內降解后提取的四種方法（2）2DE遇到的困難酸性和堿性蛋白質的分析,ＭＷ較小和較大的蛋白質的分析,低含量蛋白質的分析,高速度自動化,變性后分離不能反映原始狀態,疏水性較強的蛋白質分析,手工操作較多、經驗性強、可重復性差3.蛋白質鑒定—質譜鑒定技術

(MS)基質輔助激光解析電離質譜(MALDIMS):利用基質吸收激光的能量使得固相的多肽樣品離子化電噴霧電離質譜(ESIMS):在噴射過程中利用電場完成多肽樣品的離子化通過測量肽段離子相關參數,如飛行時間(ＴＯＦ),即可計算得到準確的肽段質量通過穩定同位素標記,還可以用質譜進行蛋白質的定量分析。質譜技術還可以用于鑒定蛋白質復合物組成、確定蛋白質翻譯后修飾的類型與發生位點等4.蛋白質相互作用分析—酵母雙雜交技術

分析蛋白質之間的相互作用及其方式,認識與特定生理活動相關的蛋白質網絡,繪制出蛋白質相互作用的圖譜(interactionmapping),是功能蛋白質組學的重要內容。酵母雙雜交是一種在細胞內檢測蛋白質的相互作用的技術,無需分離純化蛋白質,是實現大規模高通量分析的主要方法

原理:真核轉錄因子含有兩個相對獨立的功能域:DNA結合(DNAbindingdomain,BD)和轉錄激活(activationdomain,AD)。當兩者獨立存在時,無轉錄激活功能,但兩者只要相互接近,即可激活轉錄

存在問題：酵母雙雜交技術還存在假陽性和假陰性的發生率高的問題,而且對于不能進入核內的蛋白質(如分泌蛋白、膜蛋白)和存在比較復雜的翻譯后修飾作用的高等生物蛋白質,該技術尚不適用5.多維液相色譜-質譜技術

借助于同位素標記技術ICAT技術是指采用同位素標記多肽或蛋白質的親和標簽技術(isotopecodedaffinitytags,ICAT)

可以較準確的鑒定出不同狀態細胞或組織中差異表達的蛋白質

ICAT的原理分別用D0和D8試劑與同種細胞的不同形態（如正常細胞和病變細胞）中的蛋白質反應，然后把兩種反應產物混合在一起進行酶解，用親和色譜分離被標記的肽段，進行MALDI-TOF測定，如一對峰相差8個質量數，則為同一種蛋白質，由D0和D8峰的相對強度進行相對定量。

存在問題：只對含半胱氨酸殘基的蛋白質有效,而不能測定其它的蛋白質和多肽

6.蛋白芯片或微陣列

蛋白芯片技術的大多數是在玻璃板或膜上對蛋白或抗體進行排列缺陷：很難或不可能對翻譯后修飾進行分析，而翻譯后修飾對于大多數疾病又是很關鍵的五、蛋白質組研究中的生物信息學生物信息學已經成為當代生物學和醫藥學的組成部分,用于巨量生物信息資源的收集、存儲、處理、搜索、共享、服務、研究和開發。由數據庫、計算機網絡和應用軟件三大部分組成。1.數據庫各種不同類型的蛋白質數據庫,是蛋白質組研究數據存儲、管理的主要形式,是實現已知蛋白質的分析鑒定與未知蛋白的發現前提,也是總結蛋白質結構、性質與功能的規律,實現模擬與預測的基礎⑴蛋白質氨基酸序列(sequence)數據庫

常用的有PIR、SWISSPROT、TrEMBL、GenPept等。其中PIR(proteinInformationResource)和SWISSPROT是目前最常用的兩大序列數據庫,除序列之外,還提供已知蛋白質的功能、結構域、翻譯后修飾、突變體等詳盡的注釋以及和其他重要相關數據庫的交叉檢索,是最重要的蛋白質初級數據庫⑵蛋白質結構域與家族數據庫

常用的有ProSite、BLOCKS、DOMO、ProDom、Profam等⑶蛋白質高級結構及分類數據庫

常用的有PDB、SWISSMODEL、NRL3D、BioMagResBank、MMDB、SCOP、CATH等。其中PDB(ProteinDataBank)最為著名,收錄有蛋白質原子座標、晶體結構和核磁共振的數據、一級和二級結構信息及相關文獻引用⑷蛋白質2DE圖譜數據庫

包括SWEISSPROT2DEPAGE、SEINA2DEPAGE等綜合性2DE數據庫和不同生物、不同器官、組織、細胞的專一性2DE數據庫⑸蛋白質相互作用數據庫

常用的有ProNet、DIP、INTERACT等。除以上數據庫之外,還有各種類型的專一性蛋白質數據庫。上述數據庫資源,均可通過訪問ExPASy(ExpertProteinAnalysisSystem),北京大學鏡像

獲得鏈接2.工具軟件

⑴蛋白質雙向電泳圖譜分析軟件:比較知名的2DE圖像分析軟件有GenevaBioinformatics提供的Melanie4、美國ProteomeWorks公司的商用軟件包PDQuest6.1、英國公司NonlinearDynamicsLtd.的Progenesis、德國DecodonGmbH的Delta2D等應用此類軟件可完成電泳圖譜背景消減與條紋消除、斑點探測、圖形匹配和定量測定、數據存儲與分析等一系列工作。個別功能強大的軟件還具有數據統計、不同凝膠的比較、數據庫聯接檢索、斑點注釋等特殊功能⑵蛋白質鑒定工具

蛋白質的鑒定,需要利用實驗得到的相關數據,通過相關的算法與程序,進行已知蛋白質數據庫的搜索比對來完成。目前已有的鑒定工具,根據使用者提交的信息類型可以分為氨基酸組成比對、肽片段質量比對和部分肽段序列比對三類。常用的有AACompIdent、PeptIdent、ＳEQUEST、MultiIdent等⑶蛋白質的結構分析與功能預測工具

常見的有蛋白質翻譯后修飾的預測、蛋白質序列分析與二級結構預測、蛋白質結構域預測、功能域、蛋白質跨膜區預測等各種用途的工具軟件。這些工具的應用可以對蛋白質相關結構、性質與功能的實驗研究,起到一定的指導參考作用六、蛋白質組在醫學研究中的應用

1.疾病的蛋白質組研究

通過測定體液和組織的蛋白質組,我們可以尋找特異疾病的生物標記,即疾病特異性蛋白(diseasespecificproteins,DSPs)。DSPs水平的變化對于疾病診斷、治療和判斷愈后具有重要意義,還可以成為研究藥物的藥理或毒理作用的靶點。⑴腫瘤研究領域

應用DNA芯片技術實現了通過全基因組分析檢測癌變過程中基因異常活化或改變,但一些與腫瘤發生發展相關的改變可能與基因水平異常無關通過比較對腫瘤細胞和正常細胞的蛋白質表達情況,可以鑒定出腫瘤特異性標記或特異性抗原,為診斷與治療提供線索。

泌尿系統腫瘤對膀胱腫瘤細胞和尿道蛋白的大規模2D后建立了膀胱惡性腫瘤數據庫,包括移行細胞癌和鱗狀細胞癌的表達譜;進一步建立了膀胱癌患者尿液中分泌性蛋白的數據庫

其它惡性腫瘤肝癌乳腺癌原發性肺腺癌卵巢癌白血病⑵心血管疾病研究領域

目前,已經建立了人和大鼠、狗等實驗動物的心房、心室與內皮細胞的蛋白質2DE圖譜的一系列數據庫(http://www.expasy.ch/ch2d/2dindex.html),鑒定了數百個心血管系統特有的蛋白質。對擴張型心肌病(DCM)的系統的蛋白質組研究：發現了大約100個表達異常的蛋白質,并進行了分類。他們還將2DE與免疫標記相結合,鑒定了一些能和自身抗體發生反應的心臟特異性抗原。這些抗原與心臟移植中的急性或慢性排斥反應有關

缺血性心臟病SchwertzH等應用二維凝膠及電噴霧串聯質譜分析技術研究了家兔心肌缺血再灌注（I/R）以后蛋白的表達變化，并使用一種人工絲氨酸蛋白酶抑制劑FUT-175進行干預，研究了該物質對I/R損傷的保護作用。⑶神經精神系統疾病研究領域

對精神分裂癥患者以及正常人群的腦脊液進行蛋白質組學的研究。對老年癡呆癥(Ａlzhermer癥)的研究：通過對神經原纏結的2ＤＥ及質譜分析則發現,其主要蛋白質成份-微管相關蛋白τ(ＭＡＰτ)在疾病狀態下發生了磷酸化、糖基化等多種修飾作用。2.病原微生物的蛋白質組研究

⑴確定致病菌毒力;⑵尋找新的診斷標記物;⑶為疫苗的研制尋找新的候選抗原;⑷闡明藥物抗菌作用機制與病菌耐藥性發生機理,為新的抗生素的研制尋找靶點

3.蛋白質組在藥物開發中的應用

疾病特異性蛋白的不斷發現為藥物設計提供了豐富的靶點,另外通過翻譯后修飾的蛋白質組學研究,使得新藥研制獲得了前所未有的契機。以ＤＳＰｓ為靶點,分析其分子結構,定向合成有效藥物成為藥物設計的理想模式。⑴藥物靶點的發現

在病理狀態下表達異常或者特異性表達的蛋白質,以及細胞信號傳遞通路中的關鍵性蛋白,都可能作為藥物設計與發現的靶分子。病原微生物蛋白質組研究,也有助于了解其致病的機理和發現對藥物敏感的蛋白質,為新的抗生素篩選提供更合理的靶點。⑵靶點的評價、認定與篩選的優化

通過對已知藥物治療前后病理組織的蛋白質組進行比較分析,不僅可以加快藥物靶點的認定,減少后續工作的盲目性,還有助于闡明藥物的分子藥理,構建更為合理的篩選模型。將蛋白質組分析與組合化學的方法相結合,對結構類似物的構效關系作出比較,加速先導化合物的篩選與優化。⑶藥物毒理學分析與臨床前安全性評價

通過發生損傷的組織器官與正常組織器官之間的蛋白質組比較,有助于闡明藥物毒副作用的發生機制。進行已知藥物的毒理學蛋白質組分析,可以鑒定和積累特定組