纖維素（CLL）含量檢測試劑盒（微量法）原理纖維素（CLL）是由葡萄糖組成的大分子多糖，通常與半纖維素、果膠和木質素結合在一起，是植物細胞壁的主要結構成分。纖維素是一種重要的膳食纖維，是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖。CheKine?纖維素（CLL）含量檢測試劑盒（微量法）提供了一種簡單、方便、快速的CLL活性檢測方法，適用于植物組織樣本。其原理是纖維素為β－葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱能分解成β－葡萄糖。β－葡萄糖在強酸作用下，可脫水生成β－糠醛類化合物。β－糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合，生成糠醛衍生物。顏色的深淺可間接定量測定纖維素含量。包裝清單試劑盒組分規格儲存條件48T96TReagentI60mL120mL4℃，避光保存ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存ReagentIII3mL6mL4℃，避光保存StandardPowder×1vialPowder×1vial4℃注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預期差異較大的樣本進行預實驗。自備耗材·酶標儀或可見光分光光度計（能測620nm處的吸光度）·烘箱、渦旋振蕩儀、40目篩、水浴鍋、分析天平、制冰機、低溫離心機·96孔板（非聚苯乙烯材質）或微量玻璃比色皿·可調節式移液槍及槍頭·去離子水、80%乙醇、丙酮、濃硫酸·勻漿器試劑準備ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。WorkingReagentII：臨用前配制；48T加入2.8mLReagentIII，96T加入5.6mLReagentIII充分溶解，如較難溶解，可加熱攪拌；用不完的試劑4℃保存一周。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。注意：ReagentI，ReagentII和ReagentIII有毒且有刺激性氣味，建議在通風櫥進行實驗。Standard：臨用前配制；加入1mL去離子水溶解，配成10mg/mL葡萄糖溶液備用，4℃可保存兩周。標準品制備：10mg/mL葡萄糖溶液，按照下表所示，進一步稀釋成標準品：序號Standard體積去離子水體積（μL）濃度（mg/mL）Std.125μL10mg/mLStandard9750.25Std.2500μLofStd.1(0.25mg/mL)5000.125Std.3500μLofStd.2(0.125mg/mL)5000.0613Std.4500μLofStd.3(0.0613mg/mL)5000.0306Std.5500μLofStd.4(0.0306mg/mL)5000.0153Std.6500μLofStd.5(0.0153mg/mL)5000.0077Std.7500μLofStd.6(0.0077mg/mL)5000.0038Std.805000（空白管）樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存數周。測定時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環境下解凍時，需在4h內完成樣品解凍。稱取新鮮樣品0.3g（記為W1），80℃烘干2h（可適當延長）至恒重，粉碎，過40目篩。烘干樣本中加入1mL80%乙醇，90℃水浴20min（建議用封口膜封口或使用帶螺旋蓋的EP管），冷卻至室溫，8,000g25℃離心10min，棄上清。沉淀中加入1.5mL80%乙醇和丙酮各清洗一遍（渦旋振蕩2min左右，8,000g25℃離心10min，棄上清），沉淀烘干后即為粗細胞壁，稱其重量記為W2。稱取上述粗細胞壁0.01g（記為W3）加入1mLReagentI，充分混勻，90℃水浴30min（建議用封口膜封口或使用帶螺旋蓋的EP管）。取出冷卻后8,000g25℃離心10min，棄上清。沉淀中加入1mL去離子水混勻，渦旋振蕩2min左右，8,000g25℃離心10min，棄上清，沉淀用去離子水重復清洗3次（加入1mL去離子水混勻，渦旋振蕩2min左右，8,000g25℃離心10min，棄上清）。沉淀中加入1mL丙酮，混勻后8,000g25℃離心10min，棄上清，沉淀烘干待用。在上述烘干的沉淀中加入0.5mL去離子水溶解（如果不能充分溶解，可以適當勻漿或超聲促進溶解），置于冰水浴中，緩慢加入0.75mL濃硫酸，混勻，冰水浴中靜置30min，取部分上清液，用去離子水稀釋20倍，8,000g4℃離心10min，取上清液待測。注意：部分樣本中纖維素含量較低（淀粉含量較高），如米粉、板栗、甘薯等，可不稀釋或減小稀釋倍數。實驗步驟酶標儀或可見光分光光度計預熱30min，調節波長到620nm。可見光分光光度計用去離子水調零。調節水浴鍋至95℃。操作表（下述操作在1.5mLEP管中進行）：試劑空白管（μL）測定管（μL）標準管（μL）上清液01500Standard00150去離子水15000WorkingReagentII353535濃硫酸315315315混勻，置于95℃水浴中10min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻至室溫后，取200μL上層液加入微量玻璃比色皿或96孔板（非聚苯乙烯材質），于620nm處測定吸光值，分別記為A空白、A測定和A標準。計算ΔA測定=A測定-A空白，ΔA標準=A標準-A空白。注意：標準曲線和空白管只需測1-2次。實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA測定小于0.03可減小稀釋倍數或適當加大樣本量，如果ΔA測定大于1.0，樣本可用去離子水進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們為您提供的計算公式，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。標準曲線的繪制以標準溶液濃度為x軸，ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程，將ΔA測定帶入方程得到x(mg/mL)。CLL含量的計算按樣本鮮重計算CLL(mg/g鮮重)=x×V提取×20×(W2÷W3)÷W1÷1.11=22.52×x×W2÷W3÷W1按樣本細胞壁物質質量計算CLL(mg/g干重)=x×V提取×20÷W3÷1.11=22.52×x÷W31.11：是此法測得葡萄糖含量換算為CLL含量的常數，即111μg葡萄糖用蒽酮試劑顯色相當于100μgCLL蒽酮試劑所顯示的顏色；V提取：CLL提取液體積，1.25mL（0.5mL去離子水+0.75mL濃硫酸）；20：樣本稀釋倍數；W1：樣本鮮重，0.3g；W2：樣本細胞壁物質質量，g；W3，提取CLL時稱取的細胞壁物質質量，0.01g。注意事項若樣本或者干燥后的沉淀質地堅硬，可以先研碎再進行后續步驟。2.在提取CLL的過程中，首先，置于冰水浴中的EP管需要固定，不要上下左右浮動，一方面保障自身安全，另一方面防止冰水混合物進入EP管造成試驗誤差；再者，加入濃硫酸時，建議槍頭伸入樣本液面以下，緩慢加入，防止液面沸騰及樣本碳化。結果展示Figure1.本試劑盒測定番茄葉片和石