多胺氧化酶（PAO）活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理多胺氧化酶（Polyamineoxidase,PAO）是催化生物體內(nèi)多胺氧化的關(guān)鍵酶，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)多胺水平和生成物的濃度，參與各種植物體對逆境脅迫的反應(yīng)和生長發(fā)育過程。CheKine?多胺氧化酶（PAO）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動(dòng)植物組織血清或血漿等生物樣本。在該試劑盒中，PAO催化多胺氧化產(chǎn)生過氧化氫，在過氧化物酶存在的條件下與底物顯色，在500nm下有特征吸收峰，通過測定吸光值增加速率來反映PAO活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)（能測500nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。ReagentIV：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。注意：ReagentII和ReagentIV有一定的刺激性，建議在使用過程中做好個(gè)人防護(hù)。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。測定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLReagentI，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心20min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接檢測。若有沉淀，離心后測定。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到500nm，可見光分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：試劑測定孔（μL）樣本20ReagentⅠ140ReagentⅡ20ReagentⅢ10ReagentⅣ10迅速混勻，記錄500nm處吸光值A(chǔ)1和30min后吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.002可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于0.5，樣本可用ReagentⅠ進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。PAO活性的計(jì)算按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活單位定義：每毫克蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A500變化0.001定義為一個(gè)酶活力單位。PAO(U/mgprot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.001÷T=333.33×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：酶活單位定義：每克樣本在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A500變化0.001定義為一個(gè)酶活力單位。PAO(U/g鮮重)=ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷0.001÷T=333.33×ΔA÷W按樣本體積計(jì)算：酶活單位定義：每毫升液體在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A500變化0.001為一個(gè)酶活力單位。PAO(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.001÷T=333.33×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：加入的樣本體積，0.02mL；V樣總：提取時(shí)加入ReagentⅠ的體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；W：樣本質(zhì)量，g。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)對樣品進(jìn)行檢測。Figure1.本試劑盒測定小鼠肝臟和綠蘿葉中PAO的活性相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1150CheKine?過氧化物酶（POD）活性檢測試劑盒（微量法）KTB1900CheKine?單胺氧化酶（MAO）活性