ICS11.220B43DB50Enzyme-linkerimmunosorbentassayForMycoplasma2020-05-20發布重慶市市場監督管理局發布DB50/T1006—2020本標準按GB/T1.1-2009進行起草。本標準由重慶市動物疫病預防控制中心提出。本標準由重慶市農業農村委員會歸口。本標準起草人:藺露、曾政、姚璐、董春霞、孫燕、謝建華、陳忠瓊、凌洪權、梁望旺、楊澤林、程千川。DB50/T1006—2020牛肺炎支原體抗體檢測方法本標準規定了牛肺炎支原體抗體檢測方法，利用牛肺炎支原體抗體酶聯免疫吸附試驗，檢測牛肺炎支原體抗體。本方法適用于檢測牛血清（血漿）的牛肺炎支原體抗體。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T1.1-2009標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。牛肺炎支原體是指引起牛傳染性支原體肺炎（又稱爛肺病）以肺部病變為主要特征的傳染病的一種支原體。3.2酶聯免疫吸附試驗簡稱酶聯免疫法，或者ELISA法。將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應板)表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，抗體與酶復合物結合，然后通過顯色來檢測。4牛肺炎支原體P39抗原酶聯免疫吸附試驗4.1試驗材料洗液：配制見附錄第A.1章；稀釋液：配制見附錄第A.2章；標準陽性血清：含牛肺炎支原體抗體的牛血清；標準陰性血清：無牛肺炎支原體抗體的牛血清；酶結合物：辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗牛IgG；底物溶液：配制參見附錄第A.3-A.4章；終止液：配制參見附錄第A.5章。4.2操作步驟4.2.1樣品準備將被檢血清（或血漿）用稀釋液（見附錄A.2）做1:40稀釋。4.2.2加樣取出抗原包被板，A1、B1加入100μL陰性對照，C1、D1加入100μL陽性對照，其余孔加入1:40稀釋的被檢血清（血漿），每孔100μL，將加樣位置做好記錄，用封膜封板，室溫孵育30min。4.2.3洗滌1DB50/T1006—2020吸除孔內液體，每孔加300μL沖洗液（見附錄A.1）沖洗，重復5次，在吸水紙上輕拍，確保孔內無殘留液體。4.2.4加酶標抗體每孔加入酶標抗體液100μL，以封膜封板，室溫孵育30min。4.2.5洗滌洗滌方法同4.2.3。4.2.6加底物每孔加入100μL底物使用液（見附錄A.3和附錄A.4），室溫孵育10min。4.2.7終止加終止液（見附錄A.5），100μL/孔，使其終止反應。4.3結果判定設定酶標儀檢定波長在450nm（即OD值）；陽性對照均值（PC）＞0.5，陽性對照OD值的均值（PC）與陰性對照均值（NC）的比值＞4，判定實驗有效，若兩者不成立，則實驗無效，需重復；待測樣本的判定，S/P值≥0.4者判定為陽性，S/P值＜0.4為陰性樣本。S/P=其中S為待測樣本的OD值。2DB50/T1006—2020TMB(2mg/mL)底物緩沖液（pH5.5）9.5mL0.75%H2O2