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文檔簡介
晚期氧化蛋白產物(AOPP)檢測試劑盒實驗解決方案原理晚期氧化蛋白產物(AOPP)是新近發現的一類具有促炎活性的尿毒癥毒素,是血漿蛋白遭受活性氧系(ROS)攻擊后形成的氧化修飾產物。AOPP能激發單核細胞和中性粒細胞,刺激以腫瘤壞死因子TNF-ɑ為主的大量促炎性細胞因子的合成、釋放,促進產生更多的活性氧,從而誘導和加重全身氧化應激和炎癥狀態。AOPP與晚期糖基化終末產物(AdvancedGlycationEnd-Product,AGE)蛋白很相似,也發揮著相似生物功能。AOPP是腎并發癥、動脈粥樣硬化、糖尿病、代謝綜合征、免疫性疾病和惡性腫瘤等疾病的重要檢測指標。CheKine?晚期氧化蛋白產物(AOPP)檢測試劑盒(微量法)可定量檢測血漿、血清、動物組織和細胞等樣本中AOPP的含量。樣品或標準品與引發劑和終止液反應,產物在340nm處有吸收峰,通過檢測340nm處OD值,通過與標準曲線比對,確定樣品中AOPP的含量。自備耗材·酶標儀或紫外分光光度計(能測340nm處的吸光度)·96孔UV板或微量石英比色皿、可調節式移液槍及槍頭·制冰機、低溫離心機、水浴鍋·去離子水·勻漿器(如果是組織樣本)試劑準備ExtractionBuffer(1×):臨用前配制,用去離子水按1:9稀釋至1×,混勻備用。ReagentⅠ:即用型;使用前,平衡到室溫;4℃避光保存。ReagentⅡ:即用型;使用前,平衡到室溫;4℃保存。Standard:即用型;使用前,平衡到室溫;4℃保存。注意:ReagentⅡ和Standard有一定的刺激性,建議在使用過程中做好個人防護。WorkingAOPP-HSAPositiveControl:臨用前配制,用ExtractionBuffer(1×)按1:19稀釋,混勻備用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月,避免反復凍融。WorkingFree-HSANegativeControl:臨用前配制,用ExtractionBuffer(1×)按1:19稀釋,混勻備用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月,避免反復凍融。標準曲線設置:按照如下表格,用去離子水將1,000μmol/L標準品稀釋為100、80、60、40、20、10、5μmol/L的標準溶液。序號1,000μmol/L標準品體積(μL)去離子水體積(μL)標準品濃度(μmol/L)Std.1100900100Std.28092080Std.36094060Std.44096040Std.52098020Std.61099010Std.759955Std.801,0000注意:每次實驗都要做一次標準品檢測,制作標曲;稀釋后的標準品溶液不穩定,必須在4小時內使用。樣本制備1.細胞:收集細胞到離心管內,棄上清,按照每500萬個細胞加入1mLExtractionBuffer(1×),超聲波破碎細胞5min(功率20%或200W,超聲3s,間隔7s,重復30次),13,000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。2.動植物組織:稱取約0.1g組織,加入1mLExtractionBuffer(1×),進行冰浴勻漿,13,000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。3.血清和血漿:用ExtractionBuffer(1×)稀釋5倍后直接檢測。注意:如需用蛋白濃度計算,推薦使用Abbkine貨號:KTD3001的蛋白質定量試劑盒(BCA法)進行樣本蛋白質濃度測定。實驗步驟1.酶標儀或紫外分光光度計預熱30min以上,調節波長到340nm。紫外分光光度計用去離子水調零。2.96孔UV板或微量石英比色皿中按順序加入下列試劑:試劑測定孔(μL)空白孔(μL)標準孔(μL)陽性對照孔(選做)(μL)陰性對照孔(選做)(μL)樣本2000000ExtractionBuffer(1×)0200000WorkingAOPP-HSAPositiveControl0002000WorkingFree-HSANegativeControl0000200Standard0020000ReagentⅠ1010101010ReagentⅡ2020202020混勻,37℃孵育5min,記錄340nm處的吸光值,計算測定孔ΔA測=A測定-A空白,ΔA標準=A標準-A空白,陽性對照孔ΔA陽對=A陽對-A空白和陰性對照孔ΔA陰對=A陰對-A空白。注意:對照孔、空白管和標準管只需做1-2次。實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA測定小于0.002可適當加大樣本量。如果ΔA測定大于100μmol/L的ΔA標準,樣本可用ExtractionBuffer(1×)進一步稀釋,計算結果乘以稀釋倍數,或減少提取用樣本量。結果計算注意:我們為您提供的計算公式,包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。1.以各標準品濃度為y軸,ΔA標準為x軸,做標準曲線得到方程,將ΔA測帶入方程,得到y(μmoL/L)。2.樣本中AOPP濃度計算(1)按照蛋白濃度計算AOPP含量(μmol/g)=(y×V樣)÷(V樣×Cpr)×稀釋倍數=y÷Cpr×n(2)按照樣本質量計算AOPP含量(μmol/g)=(y×V樣)÷(W×V樣÷V提取)×稀釋倍數=y÷W÷1,000×n(3)按照血清和血漿計算AOPP含量(μmol/L)=y×n(4)按照細胞密度計算AOPP含量(nmol/104cells)=(y×V樣)÷(500×V樣÷V提取)=y÷500V樣:加入反應體系中樣本體積,0.2mL;V提取:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞總數,500萬;n:樣品稀釋倍數。結果展示Figure1.AOPP標準曲線Figure2.不同樣品AOPP檢測值Figure3.Free-HSA陰性對照組和AOPP-HSA陽性對照組在340nm檢測的OD值相關產品CatalogNo.ProductNameKTB1030CheKine?超氧化物歧化酶(SOD)活力檢測試劑盒(微量法)KTB1040Ch
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