第四章食品微生物檢驗方法手段2025/1/21第四章食品微生物檢驗方法手段

在食品微生物學檢驗過程中，需要采用很多方法和手段。下面就幾種常用的檢驗方法作一些基本介紹。一、顯微鏡檢驗在食品微生物學檢驗中，為了能夠發現微生物或觀察其形態、排列及某些結構，必須借助于顯微鏡。顯微鏡觀察的微生物標本一般分為兩種：染色標本和不染色標本。第四章食品微生物檢驗方法手段（一）不染色標本的檢驗在食品微生物學檢驗中，檢驗不染色標本是為了觀察微生物細胞在生活時期原有的形態、大小及確定細胞能否運動等。不染色標本的基本制片方法有以下兩種：1、壓滴法在載波片上加一滴生理鹽水，再在其中滴加少許要觀察的含菌液體或少量要觀察的固體培養物，使菌體均勻分布在生理鹽水中，然后蓋上蓋玻片，即可進行鏡檢。2、懸滴法將待觀察的含菌液體滴在蓋玻片上，然后將其反扣在凹玻片上，使液滴懸掛在凹室內。第四章食品微生物檢驗方法手段（二）染色標本的檢驗染色標本是將檢驗標本根據檢驗目的，按一定的方法涂片固定，用適當的染料染色而成的標本。經過染色，微生物細胞與其背景的色差增加，鏡檢時更加清晰可見。染色標本除能顯示微生物的形態、排列和一定的構造外，還能顯示某些細胞成分的性質及其分布的位置、區別活菌與死菌、鑒定微生物的種類。第四章食品微生物檢驗方法手段革蘭氏染色法第四章食品微生物檢驗方法手段革蘭氏染色法盧戈氏碘液媒染1min95%乙醇脫色20-30s番紅花紅復染1-2min第四章食品微生物檢驗方法手段革蘭氏染色法呈現第一次染色效果-紫色，革蘭氏染色陽性菌呈現第二次染色的效果-紅色革蘭氏染色陰性菌第四章食品微生物檢驗方法手段二、培養檢驗在食品微生物學檢驗中，分離培養是一項非常重要的工作，它對進一步確定微生物的種類和研究它們的特性等都具有重要意義。微生物的接種和培養

接種工具有：接種針、環、鉤、玻璃涂棒、接種圈、接種鋤、小解剖刀

1．接種針2.接種環3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀第四章食品微生物檢驗方法手段A劃線接種：是最常用的接種方法。即在固體培養基表面作來回直線形的移動就可達到接種的目的。常用的接種工具是接種環、接種針。劃線接種是在斜面接種和平板劃線中常用的方法。

第四章食品微生物檢驗方法手段B三點接種（點植法）：

在研究霉菌的形態時常用此法。它是把少量的微生物接種在平板表面成等邊三角形的三點上，讓它各自獨立形成菌落來觀察研究它們的形態。除三點外，還有一點或多點接種的。第四章食品微生物檢驗方法手段C穿刺法接種：

在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常用此法。所用工具是接種針，培養基是半固體培養基。具體做法：用接種針蘸取少量菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。第四章食品微生物檢驗方法手段D澆混接種（傾注法）：

是將待接的微生物先放入培養皿中，然后倒入冷卻至45左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到了稀釋的目的。待平板凝固后，置合適溫度下培養，就可長出單個生物菌落。E涂布接種（涂布法）：與傾注法略有不同,即先倒好平板，讓其凝固，然后將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液分布均勻，就可長出單個的微生物菌落。第四章食品微生物檢驗方法手段

F液體接種：

從固體培養基中將菌洗下，到入液體培養基中，或從液體培養物中用移液管將菌液接至液體培養基中，或從液體培養物中將菌液移至固體培養基中都可稱液體接種。

G注射接種：

是用注射的方法，將待接的微生物轉至活的生物體內如人或其他動物中，常見的是疫苗預防接種，來預防某些疾病。第四章食品微生物檢驗方法手段H活體接種：

是專門用于培養病毒或其他病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體內才能生長繁殖。活體可以是整個動物也可以是某個離體的活組織如猴腎，也可以是發育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養。第四章食品微生物檢驗方法手段在食品微生物學檢驗中，根據被檢材料的不同和檢驗步驟中的要求不同，在同一種培養基上可以有不同的接種方法。在進行菌落總數測定時，用的是傾注法接種，再進行各種被檢微生物得分離時，常采用劃線法接種，雖然他們用的都是瓊脂平板，但接種方法各異。食品微生物學檢驗中常用的接種方法有涂布法、劃線法、傾注法、定植法、穿刺法。第四章食品微生物檢驗方法手段傾注平板法第四章食品微生物檢驗方法手段（2）微生物的培養根據培養時是否需要氧氣，可分為

好氧培養：這種微生物在培養時，需要有氧氣加入，否則不能生長良好，實驗是中斜面培養是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養多數是通過搖床震蕩，使外界的空氣源源不斷的進入瓶中。

厭氧培養：這類微生物在培養時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養過程中，最重要的一定是要除去培養基中的氧氣。可采用以下方法除去氧氣。第四章食品微生物檢驗方法手段（1）降低培養基中的氧化還原電位：

常將還原劑谷胱甘肽，硫基酸鹽等，加如到培養基中，即可達到目的，有的將一些動物死的或活的組織如牛心羊腦加入到培養基中，也可適合厭氧菌的生長。（2）化合去氧法：

主要有焦性沒食酸吸收氧氣，用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧菌混合培養吸收氧氣，用植物的組織如發芽的種子吸收氧氣，用產生氫氣與氧化合的方法除氧。第四章食品微生物檢驗方法手段（3）隔絕阻氧：

深層液體培養，用石蠟油封存，半固體穿刺培養（4）替代驅氧：

用CO2驅代氧，用氮氣驅代氧，用真空驅代氧，用氫氣驅代氧，用混合氣體驅代氧第四章食品微生物檢驗方法手段2．培養結果的觀察各種微生物經過培養后，表現出一定特征，這在食品微生物學檢驗中，是鑒別微生物種類的重要依據。（1）固體培養基上菌落形態特征的觀察細菌在固體培養基上，經過一定時間的培養，即可出現肉眼可見的菌落，每種細菌都有一定的菌落形態和特征，主要包括菌落的大小、形狀、邊緣形態、顏色、透明度等觀察菌落的形態特征，通常先用肉眼觀察，再用放大鏡仔細觀察，必要時可用低倍鏡觀察。第四章食品微生物檢驗方法手段（2）液體培養基中培養特征的觀察主要是液體的渾濁度是否產生沉淀，液體表面有無菌膜形成，有無附著菌環，培養液的顏色以及是否產氣等。（3）半固體培養基中培養特征的觀察主要是其是否需氧及其運動情況，是在上部還是在下部深層生長，是沿穿刺線生長還是樹根樣生長。第四章食品微生物檢驗方法手段（三）生化實驗

各種微生物含有各自獨特的酶系統，用于進行代謝活動，在代謝過程中產生的產物也有各自的特點，可借此區別和鑒定微生物的種類。利用這種特點可鑒別微生物。生化試驗或生化反應是通過利用生物化學的方法來測定微生物的代謝產物、代謝方式和條件等來鑒別細菌的類別、屬種的試驗。

在進行生化實驗時，必須采用純培養，嚴禁其他種類的微生物污染，否則會出現錯誤的結果，生化實驗項目很多，應根據檢驗目的適當選擇。第四章食品微生物檢驗方法手段1.糖醇類代謝試驗此類實驗主要用于觀察微生物對某些糖類分解的能力以及不同的分解產物，從而進行微生物的鑒定，常見的實驗有以下幾種（1）糖醇類發酵試驗

不同的微生物可對各種糖類、醇類等進行分解，但不同的微生物的分解能力和產物都不相同，如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖（產酸產氣），沙門氏菌只分解葡萄糖不能分解乳糖（只產酸不產氣）。根據這一特點，在進行大腸菌群測定時，可采用乳糖發酵實驗，當大腸桿菌分解乳糖產酸時，培養基內的溴甲酚紫指示劑由藍紫色變為黃色。第四章食品微生物檢驗方法手段乳糖膽鹽發酵管產酸產氣現象第四章食品微生物檢驗方法手段（2）甲基紅實驗某些微生物如大腸桿菌、志賀氏菌等，在糖代謝過程中能分解葡萄糖產生多種有機酸，酸類增多會使培養物的濃度增大。當培養基的PH低于4.5時，甲基紅指示劑是紅色（陽性反應）；有些細菌產酸量少，培養基的PH保持在6.2以上，指示劑呈現黃色（陰性反應）第四章食品微生物檢驗方法手段（3）V-P試驗某些微生物能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸經縮合、脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇，在堿性環境中被空氣中的氧氣氧化生成二乙酰，在萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰與蛋白胨中所含的胍基成分作用生成紅色化合物，即V-P試驗陽性。

第四章食品微生物檢驗方法手段1.糖醇類代謝試驗（4）七葉苷水解試驗原理：七葉苷被細菌分解后，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與Fe2+結合，生成黑色化合物，使培養基呈黑色，以此鑒別細菌。試驗方法：將待試純培養物少許，接種于七葉苷培養基，于36±1℃培養24h,觀察結果。結果觀察與記錄（1）培養基變為黑色或棕黑色者，為陽性，記錄為+（2）培養基不變色者，為陰性，記錄-

（三）生化實驗第四章食品微生物檢驗方法手段七葉苷水解試驗單增李斯特氏菌陽性第四章食品微生物檢驗方法手段（5）B-半乳糖苷酶試驗有些微生物在含有乳糖或B-半乳糖苷化合物的存在下，產生B-半乳糖苷酶，這種酶具有活力，經一系列反應，使培養物變成深黃色。

第四章食品微生物檢驗方法手段2、蛋白質及氨基酸代謝試驗（1）靛基質（吲哚）試驗某些微生物如大腸桿菌、變形桿菌、霍亂弧菌等，含有色氨酸酶，能使培養基中色氨酸水解脫氨生成吲哚，吲哚與對二甲基氨基苯甲醛反應生成紅色的玫瑰吲哚而是紅色，即吲哚試驗的陽性反應。第四章食品微生物檢驗方法手段（2）產硫化氫試驗（沙門氏菌檢驗）某些微生物如沙門氏菌、變形桿菌、枯草桿菌、酵母菌等能水解蛋白質中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）產生硫化氫，硫化氫與二價鐵離子或鉛離子生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。第四章食品微生物檢驗方法手段2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌第四章食品微生物檢驗方法手段（3）尿素酶檢驗（沙門氏菌檢驗）某些微生物如普通變形桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、奇異變形桿菌屬、沙門氏菌的個別變種能產生尿素酶，分解培養基的尿素而產生氨，使培養基變成堿性，最終粉紅色指示劑（酚紅）變為紅色。第四章食品微生物檢驗方法手段（4）氨基酸脫羧酶試驗（沙門氏菌檢驗）某些微生物如沙門氏菌屬含有氨基酸脫羧酶，使氨基酸脫羧產生胺類和二氧化碳。胺類的存在使培養基變為堿性而使指示劑變色（溴甲酚紫陽性紫色，陰性黃色，陰性者無堿性產物，但因葡萄糖產酸而使培養基變成黃色）。常用于脫羧酶試驗的氨基酸有鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸。（5）苯丙氨酸脫氨試驗某些微生物具有苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸氧化脫氨形成苯丙酮酸。苯丙酮酸遇到三氯化鐵成藍綠色。本試驗可用于多種微生物的鑒定。第四章食品微生物檢驗方法手段（6）明膠液化試驗

某些微生物能分泌明膠（一種動物蛋白）水解酶（蛋白質）而水解明膠，使經培養后的明膠培養基有原來的固態變為液態。3.呼吸酶類試驗（1）硝酸鹽還原試驗某些細菌能把培養基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽或氨或氮等。當加入格里斯試劑后，亞硝酸鹽與乙酸反應生成亞硝酸。亞硝酸與對氨基苯磺酸作用形成偶氮苯磺酸，偶氮苯磺酸與α-萘胺結合形成紅色的偶氮化合物N-α-荼氨偶氮苯黃酸，即為陽性反應。陰性反應的原因有兩個：一是細菌不能還原硝酸鹽，則培養后的培養液中仍有硝酸鹽的存在；二是細菌將亞硝酸鹽還原為氮或氨等物質，則培養基中沒有硝酸鹽的存在。

第四章食品微生物檢驗方法手段硝酸鹽還原試驗操作步驟：接種硝酸鹽肉湯，35℃培養5天，加入0.2ml的試劑A,再加入0.2ml的試劑B,輕搖混合。呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色者表明有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。若無顏色變化，須加入少量鋅粉變紅者為陰性（硝酸鹽未被還原）不變為陽性（亞硝酸鹽已分解成氨和氮）第四章食品微生物檢驗方法手段（2）細胞色素氧化酶試驗分子氧和細胞色素C，能氧化鹽酸二甲基對苯二胺，并和α-萘酚結合，生成吲哚酚藍（靛酚藍），是藍色反應。（3）過氧化氫酶試驗過氧化氫酶又稱接觸酶，能將水分解而釋放氧氣，大多數好氧或兼性厭氧微生物能產生過氧化氫酶,一般厭氧微生物不產生此酶（如乳酸細菌）第四章食品微生物檢驗方法手段

觸酶試驗左側陽性,右測為陰性對照第四章食品微生物檢驗方法手段4.有機酸鹽和氨鹽利用試驗（1）檸檬酸鹽利用試驗某些微生物（產氣桿菌）能利用氨鹽作為唯一氮源，同時利用檸檬酸鹽作為唯一碳源。他們可在檸檬酸鹽培養基上生長，并分解檸檬酸鈉而生成碳酸鈉，使培養基變為堿性，培養基中的指示劑溴百里酚藍，由原來的草綠色變為藍色。第四章食品微生物檢驗方法手段（2）丙二酸鹽利用試驗琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環中一個重要環節。丙二酸與琥珀酸會競爭琥珀酸脫氫酶，在丙二酸濃度較高的情況下，琥珀酸脫氫酶不能被釋放出來催化琥珀酸脫氫反應，從而抑制了三羧酸循環反應進行，微生物的生長也受到了抑制，也有些微生物在丙二酸鈉培養基上能夠生長，使培養基變為堿性，溴百里酚藍，由原來的草綠色變為藍色，說明這些微生物能夠利用丙二酸鹽。第四章食品微生物檢驗方法手段

5.毒性酶試驗（1）卵磷脂酶試驗有些微生物能產生卵磷脂酶，即X-毒素，在有鈣離子存在時，能迅速分解卵磷脂，生成脂肪和水溶性磷酸膽堿，當這些微生物在卵黃胰胨培養液中生長時，可出現白色沉淀（脂肪）。第四章食品微生物檢驗方法手段（2）血漿凝固酶試驗

致病性葡萄球菌（金黃葡萄球菌）能產生血漿凝固酶，他們可直接作用于血漿中的纖維蛋白，也可作用于血漿凝固酶原，是之成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發生凝固，這是鑒定致病球菌的重要指標,是否是致病球菌主要看它是否產生凝固酶.有凝塊均勻混濁均勻混濁生理鹽水第四章食品微生物檢驗方法手段金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗

第四章食品微生物檢驗方法手段（3）鏈激酶試驗

A型溶血鏈球菌能產生鏈激酶（溶解纖維蛋白酶），該酶能激活人體血液中的血漿蛋白酶原，形成血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。在檢驗溶血