CCSC50江蘇省地方標準傳染病突發公共衛生事件應急處置技術規范第10部分：病毒類應急檢測技術2024-12-27發布2025-01-27實施江蘇省市場監督管理局發發出布版Ⅰ前言 Ⅲ引言 Ⅳ 2規范性引用文件 3術語和定義 4生物安全要求 5準備工作和質量控制 6分子生物學應急檢測技術 7免疫學應急檢測技術 參考文獻 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。DB32/T4972已經發布了以下部分：——第1部分：監測預警；——第2部分：事件報告和管理；——第3部分：風險評估；——第4部分：現場流行病學調查；——第5部分：恢復評估；——第6部分：應急消毒處置及應急人員個人防護；——第7部分：媒介生物應急監測、評估與控制；——第8部分：標本的采集、保存和運輸；——第9部分：應急檢測流程；——第10部分：病毒類應急檢測技術；——第11部分：細菌類應急檢測技術。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由江蘇省衛生健康委員會提出并組織實施。本文件由江蘇省衛生健康標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預防控制中心、南京市疾病預防控制中心、鹽城市疾病預防控制中心。Ⅳ引言傳染病突發公共衛生事件是江蘇省公共衛生安全的主要威脅，對社會、經濟和人群健康造成巨大影響。本文件為貫徹落實《中華人民共和國傳染病防治法》《中華人民共和國突發事件應對法》《突發公共衛生事件應急條例》等法律法規對傳染病突發公共衛生事件的應急處置要求，提升江蘇省傳染病突發公共衛生事件的應急處置能力，保障人民群眾的生命安全和社會穩定的目標而制定。DB32/T4972《傳染病突發公共衛生事件應急處置技術規范》由以下11個部分構成：——第1部分：監測預警；——第2部分：事件報告和管理；——第3部分：風險評估；——第4部分：現場流行病學調查；——第5部分：恢復評估；——第6部分：應急消毒處置及應急人員個人防護；——第7部分：媒介生物應急監測、評估與控制；——第8部分：標本的采集、保存和運輸；——第9部分：應急檢測流程；——第10部分：病毒類應急檢測技術；——第11部分：細菌類應急檢測技術。DB32/T4972的制定是對傳染病突發公共衛生事件處置工作相關國家標準、行業標準的有力補充，為開展傳染病突發公共衛生事件的監測預警、報告和管理、風險評估、現場流行病學調查、恢復評估、應急消毒處置和個人防護、媒介生物的應急監測評估與控制、標本的采集和檢測等應急處置工作提供有力的科學依據和技術支撐，對保障公眾健康和公共衛生安全具有重要意義。1DB32/T4972.10—2024傳染病突發公共衛生事件應急處置技術規范第10部分：病毒類應急檢測技術本文件規定了傳染病突發公共衛生事件應急處置中病毒類應急檢測的生物安全要求、準備工作和質量控制、分子生物學應急檢測技術和免疫學應急檢測技術等。本文件適用于傳染病突發公共衛生事件應急處置中病毒類傳染病病原體的應急檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求WS233病原微生物實驗室生物安全通用準則3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1高通量測序high?throughputsequencing區別于傳統Sanger（雙脫氧法）測序，能夠一次并行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術，通常一次測序反應能產出不低于100兆的測序數據。注：又稱下一代測序技術（Next?generationsequencing，NGS）或大規模平行測序（Massivelyparallelsequencing，4生物安全要求4.1實驗人員應根據GB19489和風險評估的要求，配備不同類型傳染病感染的個人防護裝備，包括但不限于防護服、手套、外科口罩或醫用防護口罩、防護面屏、防護帽。防護服宜每隔4h更換一次。在發生意外暴露時，根據應急處置預案采取必要措施。要求。4.3依據《醫療廢物管理條例》規定處置醫療廢物。5準備工作和質量控制5.1準備工作5.1.1根據實驗需要，準備相應的生物安全柜、移液器、漩渦震蕩儀、離心機等儀器和檢測試劑耗材。2DB32/T4972.10—20245.1.2標本震蕩后瞬時離心取上清用于病毒類核酸提取及抗原檢測。5.1.3按照病毒RNA/DNA核酸提取試劑盒說明書，取適量標本進行核酸提取，提取完成后應立即封蓋并馬上進行分子生物學檢測。剩余的標本和核酸應于-80℃條件下凍存。5.2質量控制5.2.1每一批次反應過程中應至少設置一個陰性和陽性對照，必要時增加空白對照。5.2.2測序過程中數據Q30（用于衡量高通量測序中堿基準確度的指標，測序數據中堿基識別質量值為30，表示其堿基識別準確率為99.9%）應≥80%。5.2.3宏基因組測序提取的核酸中DNA的A260/A280值應>1.8，RNA的A260/A280值應≥2.0。背景核酸模型應每個月更新1次。6分子生物學應急檢測技術6.1實時熒光PCR技術（Real?timePCR）6.1.1反應體系配制（PCR反應液、酶、引物、探針及模板）及反應程序設置（反應溫度、循環數及熒光通道）應參照相應病毒核酸檢測試劑盒說明書。6.1.2陰性對照、陽性對照、內參（如有）結果成立時，進行結果判斷。陰性顯示無Ct值、無S形擴增曲線，陽性顯示Ct值小于或等于病毒核酸檢測試劑盒說明書規定值，且有S形擴增曲線。6.2等溫擴增技術6.2.1將核酸模板（RNA病毒先進行反轉錄合成第一條cDNA鏈）或標本上清、引物、DNA合成酶、基質等共同置于商品化試劑盒指定溫度下，經一個步驟即可完成。6.2.2當陰性對照、陽性對照結果成立時，應使用以下方法進行結果判定：a）濁度檢測：肉眼觀察反應管內出現白色渾濁判定為陽性，未渾濁判為陰性；b）熒光檢測：加入熒光指示劑后，根據試劑盒說明書判定結果。6.3數字PCR技術6.3.1根據PCR儀器和試劑的要求制備反應體系，將體系分配到微小分區或微滴中并封蓋，進行PCR反應。使用熒光染料或探針監測目標核酸的擴增，配套軟件統計分析各反應中的陽性液滴數。6.3.2當陰性對照、陽性對照、內參（如有）結果成立時，進行結果判斷，確定目標核酸及其定量信息，包括標本中每個熒光通道的濃度、精度、誤差，依據試劑盒說明書進行結果判讀。6.4高通量測序技術6.4.1單一病原體及靶向測序按照試劑盒說明進行目的基因的擴增富集純化，純化后產物進行文庫構建、上機測序、數據分析等步驟。宏基因組測序對符合要求的核酸進行文庫構建、上機測序、數據分析等。具體反應體系及反應程序參照相應測序平臺及試劑盒說明書，根據應急檢測實際選擇是否執行去宿主操作。6.4.2單一病原體及靶向測序完成后，當序列覆蓋度、測序深度滿足質控標準時，可進行病毒分型與突變位點分析。宏基因組測序完成后，應先過濾背景核酸模型，找出標本中相對明確檢出的微生物列表，分析微生物的序列特征及物種檢出情況，最后結合臨床資料綜合分析判定。37免疫學應急檢測技術7.1免疫膠體金技術7.1.1檢測標本的類型、上樣體積及操作步驟參照相應的試劑盒說明書。7.1.2實驗完成后按照試劑盒的要求的時間對結果進行觀察，當檢測線和質控線均為陽性結果時，判定對應的檢測項目陽性；當質控線為陽性，檢測線為陰性結果時，判定對應的檢測項目為陰性；當質控線為陰性時，判定結果為無效結果，需重復實驗。7.2酶聯免疫吸附測定技術（ELISA）7.2.1參照試劑盒說明書依次加入抗原包被（如需要）、待檢標本上清及對照、酶標記物、底物、終止液，具體流程參照相應病毒ELISA檢測試劑盒說明書。7.2.2以空白對照調零，讀取酶標儀器上各孔450nm和（或）492nm等波長的OD值，參照說明書要求設置參比波長并計算陽性值，判定結果。7.3化學發光技術7.3.1參照試劑盒說明依次加入磁性顆粒抗原包被、待檢及對照血清、堿性磷酸酶標記的蛋白、底物、堿性磷酸酶催化底物液發光，具體流程參照相應病毒化學發光檢測試劑盒說明書。7.3.2根據化學發光試劑盒的生物參考區間判定實驗結果。每