第10章微生物發酵制藥工藝

本章內容2.1概述2.2制藥微生物生長與生產的關系2.3制藥微生物菌種的建立2.4培養基制備2.5滅菌工藝2.6微生物發酵培養技術2.7發酵工藝過程的檢測與控制控制10.1微生物發酵與制藥發酵發酵制藥發酵制藥的基本過程微生物，是一類體積微小、種類繁多、分布廣泛、數量龐大的生物，包括細菌、放線菌和霉菌等。1發酵概念概念：通過微生物培養而獲得產物的過程。種類：用產品說明，冠以產物名而成，如青霉素發酵，維生素發酵；發酵工程按需氧分為好氧發酵和厭氧發酵。初級代謝產物：在初級代謝過程中形成的產物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質、脂肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機酸。次級代謝產物：比較復雜的化合物，不是細胞生長必需的，對生命活動有意義。抗生素，毒素，色素。2

發酵制藥概念利用制藥微生物的生長繁殖，通過發酵，代謝合成藥物，然后從中分離提取、精制純化，獲得藥品的過程抗生素的發現

1928年，英國細菌學家FlemingB發現抗菌物質青霉素。在20世紀40年代，一共發現了14種抗生素，50年代發現了20余種，60年代開始了化學結構改造的合成和半合成抗生素階段。目前發現并分離到約9000種抗生素，半合成抗生素約1000種，共萬種以上。但實際生產和應用的只有100余種。制藥微生物的種類細菌、放線菌和絲狀真菌細菌主要生產環狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產生桿菌肽（bacitracin）。細菌還可以產生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacteriumflarum）產生谷氨酸，大小菌生產維生素C。放線菌主要產生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環類（四環素、金霉素、土霉素等）、放線菌素類（放線菌素D）大環內酯類（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大環內酯類（制霉菌素、抗滴蟲霉素等）。真菌的曲菌屬產生桔霉素，青霉素菌屬產生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產生頭孢霉素等。3發酵制藥的基本過程

菌種選育發酵工段純化工段成品工段孢子制備種子制備發酵控制預處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實驗室、種子庫發酵車間提煉車間包裝車間10.2微生物的生長特征1、微生物發酵基本過程特征/菌體生長與產物生成的特征，三個階段發酵前期(fermentationprophase)菌體生長期發酵中期(fermentationmetaphase)產物合成（分泌）期發酵后期(fermentationanaphase)菌體自溶期(cellautolysisphase)發酵前期特征從接種至菌體達到一定臨界濃度的時間，包括延滯期、對數生長期和減速期。代謝特征：碳源、氮源等基質不斷消耗，減少生長特征：菌體不斷地生長和繁殖，生物量增加。溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時，濃度最低。pH變化：先升后降－先氨基酸作為碳源，釋放出氨，而后氨被利用。先降后升－先用糖作為碳源，釋放出丙酮酸等有機酸，后又被利用。發酵中期特征以次級代謝產物或目標產物的生物合成為主的一段時間。菌體生長恒定就進入產物合成階段呼吸強度：無明顯變化，不增加菌體數目產物量：逐漸增加，生產速率加快，直至最大高峰，隨后合成能力衰退。對外界變化敏感：容易影響代謝過程，從而影響整個發酵進程。發酵后期特征菌體衰老，細胞開始自溶的一段時間合成產物能力衰退，生產速率減慢。氨基氮含有增加，pH上升發酵必須結束，否則產物被破壞菌體自溶給過濾和提取等帶來困難。自溶作用（autolysis）自溶作用是細胞的自我毀滅，速溶酶體將酶釋放出來將自身細胞降解。在正常情況下，溶酶體的膜是十分穩定的，不會對細胞自身造成傷害。如果細胞受到嚴重損傷，造成溶酶體破裂，那么細胞就會在溶酶體酶的作用下被降解，如某些紅細胞常會有這種情況發生。在多細胞生物的發育過程中，自溶對于形態建成具有重要作用。2、制藥微生物的生長動力學菌體的生物量與時間的關系是S形曲線生物量X延滯期對數生長期減速期靜止期衰亡期培養時間t14(1)延遲期

延滯期（lagphase）或適應期是指接種后，菌體的生物量沒有明顯增加的一段時間。延遲期是菌體適應環境的過程。延遲期時間長短不一，與遺傳和環境因素有關，由菌體與環境相互作用的程度決定的。因不同接種量、不同菌種和菌齡等而表現不同。工業上希望延遲期越短越好，常采用如種子罐與發酵罐培養基盡量接近，對數期的菌體作為種子、加大接種量等方法進行放大培養和發酵生產。15(2)對數生長期

對數生長期（logphase）是菌體快速繁殖，生物量的增加呈現對數速度增長的過程。特點是生長速率達到最大值，并保持不變。細胞的化學組成與生理學性質穩定。菌體生長不受限制，細胞分裂繁殖和代謝極其旺盛。可以認為細胞組分恒定，菌體細胞的生長速率與生物量是一級動力學關系。

（3）減速期

減速期(declinephase)是指菌體生長速率下降的一段時間。由培養基中基質濃度下降，有害物質積累等不利因素引起。在減速期內，生長速率與菌體濃度仍符合一級動力學關系，但受基質濃度限制。一般生物的減速期較短。（4）靜止期

靜止期(declinephase)是指菌體凈生長速率為零的一段時間。分裂與死亡同步進行，生長和死亡速率相等。17（5）衰亡期

衰亡期(declinephase)是指菌體死亡速率大于生長速率的一段時間，這時，細胞自溶，死亡加速，細胞濃度迅速下降。菌體死亡速率也符合一級動力學：183、基質利用動力學菌體的的生長過程，隨著基質逐漸被吸收利用，基質濃度降低基質濃度X培養時間t4、生長與產物的關系模型從菌體生長、能源利用和產物生成速度的變化及其之間的動力學關系出發，Gaden把發酵過程分為三種模型。

I型：菌體生長與產物生成偶聯型(couplingmodel)

菌體的生長與產物生成直接關聯，生長期與生產期是一致的。細胞生長、基質消耗、能源利用和產物生成動力學曲線幾乎平行，變化趨勢同步，都有最大值，出現的時間接近。乳酸、醋酸等初級分解代謝產物的生成也屬于此類型。所以產物生成速率和比速率分別為：生物量或產量p比生長或比生長速率時間t時間t時間t時間t時間t時間tII型：菌體生長與產物生成半偶聯型（semi-couplingmodel）

該模型介于偶聯和非偶聯模型之間，產物生成與基質消耗、能量利用之間存在間接關系。產物來自能量代謝所用的基質，但是在次級代謝與初級代謝分開的。在細胞生長期內，基本無產物生成，在生長的中后期生成大量的產物而進入產物形成期。分批發酵出現兩個高峰，先是基質消耗和菌體生長的高峰，然后是產物形成的高峰。如檸檬酸和某些氨基酸的發酵，一部分組成型表達的蛋白質藥物也屬于此類型。產物生成速率和比速率分別為：

生物量或產量p比生長或比生長速率時間tIII型：菌體生長與產物生成非偶聯型（non-couplingmodel）

菌體生長期與產物生成期為獨立的兩個階段，先形成物質消耗和菌體生長高峰，幾乎沒有或很少有產物生成，然后進入菌體生長靜止期，產物大量生成，并出現產物高峰。產物可能來自于中間代謝途徑，而不是分解代謝過程，物質消耗和菌體生長之后，菌體利用中間代謝途徑，初級代謝與產物形成是完全分開的，如抗生素、生物堿、微生物毒素的發酵。對于誘導型基因工程菌，往往在靜止期，加入誘導物，基因轉錄和產物表達，所以產物生成速率和比速率分別為：

時間t時間t生物量或產量p比生長或比生長速率5、代謝產物的生物合成

代謝（metabolism）是生物體內進行的生理生化反應的統稱。代謝分為分解代謝(catabolism)和合成代謝(anabolism)，前者是指把大分子降解為小分子的過程，為合成代謝提供能量和原料；而后者是指把小分子合成為復雜大分子的過程，滿足細胞生長和分化的需要。

初級代謝是營養物質轉變為細胞結構物質和對細胞具有生理活性作用的物質，為細胞提供能量、合成中間體及其生物大分子的代謝網絡。初級代謝產物包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質、脂肪、核酸等。幾乎所有生物的初級代謝基本相同。

次級代謝存在于某些生物中，并在一定時期表達。次級代謝對正常的生長可能不必要，但對抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意義。（1）次級代謝產物生物合成的基本特征

結構：次級代謝產物種類繁多，結構特殊，含有不常見的化合物和化學鍵。如氨基糖、苯醌、香豆素、環氧化合物、生物堿、內酯、核苷、雜環等基團，聚乙烯不飽和鍵、大環、環肽等鍵。

種屬性：具有種屬特異性，與種屬分類學無關。分類學上相同的菌種能產生不同結構的抗生素，如灰色鏈霉菌既可以產生氨基環醇類抗生素，又可以產生大環內酯類抗生素。分類學上不同的菌種能產生相同結構的抗生素，如霉菌和鏈霉菌均可產生頭孢菌素C。一種微生物的不同菌株產生結構不同的多種次級代謝物，而同一菌株會產生一組結構類似的化合物。形成時期：生長期轉向生產期，形態與生理發生變化。次級代謝產物是在細胞生長后期開始形成，當生長受限制時被啟動。完成菌體營養生長期之后，出現次級代謝物合成期，其生物合成比生長對環境更敏感，要求更高。次級代謝產物是以初級代謝產物為前體，受到初級代謝的調節。可能是缺乏某種營養成分，菌體生長抑制，啟動了次級代謝物合成。菌體內中間代謝物積累，抑制了初級代謝酶，使之消失或活性下降，誘導了新酶的出現，轉入生產期。芽孢桿菌形成芽孢，放線菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是細胞分化的伴隨現象。組成：次級代謝產物是結構相似的一組混合物，但活性差異較大。參與反應的酶的底物特異性不強。產生菌利用一種或兩種以上的初級代謝產物合成一種主要的次級代謝產物，并繼續對該產物進行修飾生成多種衍生物。一種次級代謝產物可由兩種或兩種以上代謝途徑合成。合成基因：次級代謝產物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色體外，還有細胞質遺傳物質，可能存在于質粒、線粒體基因。遺傳物質的變異和丟失是導致菌種退化和生產不穩定的重要因素，所以具有代謝不穩定性。(2)次級代謝產物的構建單位

微生物合成的次級代謝產物是由微生物代謝產生的一些中間產物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初級代謝產物合成。

把構成次級代謝產物的基本結構單位稱為生源（biogen）。生源直接或間接來源于次級代謝過程的中間產物或初級代謝產物。構建單位包括聚酮體、甲羥戊酸、糖類、不常見的氨基酸（如D－氨基酸、β－氨基酸等）、環多醇和氨基環多醇等。(3)次級代謝產物的生物合成的基本過程次級代謝產物的合成基本過程包括構建單位的聚合—再修飾—裝配。在此過程中，次級代謝產物的累積受合成途徑中某些酶活性的限制，這些關鍵酶活性大小與產量正相關。前體聚合:微生物合成生源后，通過縮合反應形成聚酮體、寡肽、聚乙烯等。結構修飾:包括糖基化、酰基化、甲基化、羥基化、氨基化、氧化還原等，使抗生素產生了共存的系列類似物。裝配:合成各個組分后，需要按一定順序在特異酶作用下組裝，才能形成有活性的藥物。菌種選育原因：高產量的菌種，自然界中的菌種生長繁殖快速，發酵有大量積累產物。誘變育種方法：天然變異，物理因子，化學因子和生物因子。20世紀80年代，以原生質體融合的雜交育種和基因工程育種，90年代以后，可以用基因組shuffling育種。10.3制藥微生物菌種的建立1、新藥生產菌的選育自然分離自然選育誘變育種雜交育種基因工程技術育種基因組重排微生物藥物與菌種的篩選流程樣品采集微生物分離培養篩選方法學建立篩選鑒定前藥－新化合物化合物分離純化陽性結果

生產出發菌菌種鑒定與保藏新化合物新藥研究與開發（1）生產菌的自然分離來源：大陸土壤、海洋水體樣品的采集：80%表層土壤（0－10cm），海洋（0－100m）欲處理：根據分離目的和微生物的特性，用物理和化學的方法處理。A溫度；高溫可得到放線菌。BSDS－酵母膏，CaCO3、NaOH處理，減少細菌，有利于放線菌分離；乙酸乙酯、氯仿、苯處理，除去真菌C離心、膜過濾培養基：選擇適宜的培養基，營養和pH；添加抑制劑。分離方法：a稀釋法：無菌水，生理鹽水，緩沖液b濾膜法：0.22－0.45μm。細菌在膜上，放線菌菌絲可穿透，進入培養基。培養條件：溫度。放線菌：25－30℃，32－37℃，7－14天至1月；45－50℃，1~2d。瓊脂擴散法——活性測定：非致病菌為對象，耐藥細菌和厭氧菌的抗生素，篩選生物活性物質。HPLC、LC－MS等，分析鑒定活性物質(2)自然選育定義：不經過人工誘變處理，根據菌種的自然突變而進行的菌種篩選過程。應用：（1）菌種的提純復壯。（2）防止退化，穩定生產水平。1年1次。過程菌種單孢子平板分離單菌落測活優良菌株效率低,增產幅度小(3)誘變育種定義：人為創造條件（誘變劑處理），使菌種發生變異，篩選優良個體，淘汰劣質個體。物理類：紫外線，快中子，激光，太空射線。化學類：堿基類似物，嵌合劑，亞硝酸。生物類：噬菌體，轉座子。特點：快速，簡單，效益大。缺點：無定向性。誘變育種流程出發菌種單孢子懸液誘變處理高產菌株單菌落初篩稀釋涂板復篩穩定性特性中試放大投入生產（3）雜交育種概念：兩個不同基因型的菌株，通過結合或原生質體融合，使遺傳物質發生重新組合，從中分離篩選出具有優良性狀的新菌株。特點：有一定的定向性。種類：接合原生質體融合接合育種范圍：細菌、放線菌過程：兩種細胞混合培養基因片段進入另一細胞合子

重組單倍體雖然有成功報導,

但多數效果不顯著原生質體融合育種概念通過生物學、化學或物理學的方法，使兩個不同種類的體細胞融合在一起，從而產生具有兩個親本遺傳性狀的新細胞.用去壁酶處理將微生物細胞壁除去，制成原生質體，在高滲條件下，用聚乙二醇（PEG）促進原生質體發生融合，再生細胞壁，從而獲得異核體或重組子，這一技術叫原生質體融合。2

菌種保藏原因：菌種經過多次傳代，會發生遺傳變異，導致退化，從而喪失生產能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優良特性，延長生命時限，長期存活、不退化。原理：使菌種代謝處于不活躍狀態，即生長繁殖受抑制的休眠狀態。措施：物理和化學方法（溫度：低溫；水分：干燥；氧氣：缺氧；營養；缺乏）保藏方法低溫斜面保藏：低溫降低新陳代謝。4℃，RH70％以下。短期保藏，1－6個月；易變異石蠟封存：隔絕氧氣，減少蒸發。4℃，約1年。砂土管保藏：干燥抑制生長。孢子吸附在砂土上，真空抽氣干燥。干燥器于冰箱，數年。冷凍干燥保藏：保護劑降低菌體細胞冰點，減少冰晶對細胞傷害。低溫避光，中期保藏，5～10年。液氮保藏：培養物與冷凍保護劑混合，密封。液氮（－196℃）罐或－80℃冰箱。低溫、缺氧、避光和營養缺乏環境。長期保藏。3保藏機構－中國中國典型培養物保藏中心:ChinaCenterforTypeCultureCollection(CCTCC)。中國科學院典型培養物保藏委員會,下設9個庫中國普通微生物菌種保藏管理中心：ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter(CGMCC)，微生物所（真菌和細菌）；武漢所（病毒）抗生素菌種保藏管理中心（CACC）：中國醫學科學院抗生素所，四川抗生素所，華北制藥集團抗生素所10.4培養基制備概念（medium）供微生物生長繁殖和合成各種代謝產物所需要的按一定比例配制的多種營養物質的混合物。培養基的組成和比例是否恰當，直接影響微生物的生長、生產和工藝選擇、產品質量和產量。1培養基的成分碳源氮源無機鹽水生長因子前體與促進劑消泡劑碳源(carbonsources)概念：構成微生物細胞和代謝產物中碳素的營養物質。作用：為正常生理活動和過程提供能量來源，為細胞物質和代謝產物的合成提供碳骨架。種類：糖類：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油和豬油醇類：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類、有機酸遲效碳源：酪蛋白水解產生的脂肪酸氮源（nitrogensources）概念：構成微生物細胞和代謝產物中氮素的營養物質。作用：為生長和代謝主要提供氮素來源。種類：無機氮源、有機氮源有機氮源幾乎所有微生物都能利用有機氮源：黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、尿素。無機氮源氨水、銨鹽和硝酸鹽等。氨鹽比硝酸鹽更快被利用。工業應用：主要氮源或輔助氮源；調節pH值生理酸性物質：代謝后能產生酸性殘留物質。（NH4）2SO4利用后，產生硫酸生理堿性物質：代謝后能產生堿性殘留物質。硝酸鈉利用后，產生氫氧化鈉。無機鹽和微量元素概念：組成生理活性物質或具有生理調節作用礦物質作用方式：低濃度起促進作用，高濃度起抑制作用。種類：鹽離子磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣，常常添加鐵、鋅、銅、鉬、鈷、錳、氯，一般不加。水菌體細胞的主要成分。營養傳遞的介質。良好導體，調節細胞生長環境溫度。培養基的主要成分之一。生長因子（growthfactor）概念：維持微生物生長所必需的微量有機物，不起碳源和氮源作用。種類：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無需添加。營養缺陷型菌株：必需添加。前體(precursor)概念：加入到發酵培養基中的某些化合物，被直接結合到目標產物分子中，而自身的結構無多大的變化。使用：添加前體是提高抗生素產量的重要措施。多次少量、連續流加的工藝。促進劑(accelerant)概念：促進產物生成的物質，但不是營養物，也不是前體的一類化合物。種類：氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，起誘導作用。消沫劑（defoamingagent）概念：降低泡沫的液膜強度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。種類：表面活性劑，低表面張力。天然動植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）。作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。2培養基種類培養基的種類按用途：選擇性、鑒別性、富營養培養基等按物理性質：固體，半固體、液體培養基按化學組成：合成、半合成、天然培養基按發酵過程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發酵和補料培養基。固體培養基概念：（solidmedium）細菌和酵母的固體斜面或平板培養基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養基。制備：液體培養基添加1.0-2.0%瓊脂粉。作用：提供菌體的生長繁殖，形成孢子。種子培養基概念：（seedmedium）供孢子發芽和菌體生長繁殖，搖瓶和種子罐培養基,為液體。作用：使種子擴大培養，增加細胞數目，生長形成強壯、健康和高活性的種子。發酵培養基概念：(fermentationmedium)提供微生物生長、目標產物生成的生產用培養基。作用：不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標產物，是發酵生產中最關鍵和最重要的培養基。補料培養基(fedmedium）概念：發酵過程中添加補充的培養基。作用：穩定工藝條件，延長發酵周期，提高目標產物產量組成：各種必要的營養物質，碳源、氮源、前體制備：按單一成分配制，各自獨立控制，或按一定比例制成復合補料培養基。3制藥生產用培養基的配制一般設計原則設計思路計算與定量配制優化（1）培養基設計一般原則生物學原則：根據不同微生物營養和反應需求設計。營養物質組成：較豐富，濃度適當。成分之間比例：恰當，C/N比適宜。原料之間：不能產生化學反應。適宜的pH和滲透壓工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過程容易控制。低成本原則：原料來源方便，質量穩定，質優價廉。高效經濟原則：滿足菌體生長和合成產物的需求，最高得率，最小副產物。（2）培養基設計基本思路

起始培養基：根據他人的經驗和使用。單因素實驗：確定最適宜的培養基成分。多因素實驗：各成分之間最佳配比和濃度優化。中試放大試驗：搖瓶、小型發酵罐，到中試，最后放大到生產罐。綜合考慮各種因素，產量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產配方。（3）理論計算與定量配制微生物生長和生產可用下列表達式表示：碳源和能源＋氮源＋其他營養物質→細胞＋產物＋CO2＋H2O＋熱量單位細胞生物量所需最小的營養物質單位產量的最小底物濃度碳源和氮源進行轉化率計算和分析初步計算：參考微生物的化學和元素組成。轉化率：單位質量原料生產的產物量或細胞量。理論轉化率：根據代謝途徑的物料衡算實際轉化率：發酵過程中實際測量數值計算。目標：使實際轉化率靠近理論轉化率。4滅菌工藝滅菌方法與原理培養基滅菌工藝空氣除菌工藝概念：雜菌，除生產菌以外的任何微生物。污染，感染雜菌的培養或發酵體系。消毒，殺滅或清除病原微生物，達到無害化程度，殺滅率99.9%以上。殺菌，殺滅或清除一切微生物，達到無活微生物存在的過程，殺滅率99.9999%以上。滅菌，微生物殺滅率99.999999%以上。(1)滅菌方法與原理1、化學滅菌2、物理滅菌化學滅菌用化學物質殺滅微生物的滅菌操作。化學滅菌劑：氧化劑類等，鹵化物類，有機化合物等。機理：蛋白質變性，酶失活，破壞細胞膜透性，細胞死亡。應用：皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌。物理滅菌各種物理條件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進行滅菌紫外線等射線：局部空間干熱滅菌：實驗室器皿蒸汽滅菌：培養基效果好，操作方便，廣泛使用。干熱滅菌在高溫120℃以上，蛋白質、酶、核酸、生物膜等生物大分子變性、凝聚破壞，甚至是降解，生物細胞破裂，內容物釋放，生物體死亡。對于干熱滅菌，足夠長的時間和足夠高的溫度，都可以殺滅生物體。干熱滅菌效果沒有濕熱滅菌好，是實驗室常用的器皿的方法。工業采用160℃、2h，或170℃、1h干熱空氣，用于需保持干燥的器械、容器的滅菌。溫度越高，時間相應縮短。蒸汽滅菌濕熱滅菌效果優于干熱滅菌;原因在于濕熱狀態下，穿透力強，蒸汽冷凝時釋放出大量能量，使蛋白質、核酸等內部的化學鍵破壞、降解，導致生物體死亡。一般在115℃～140℃，保持一段時間，可以殺死各種生物體。濕熱滅菌常用于培養基和設備容器的滅菌。常用條件為115℃～121℃，壓力1×105Pa，維持15～30分鐘。芽孢是一種休眠體，外面有厚膜包裹，耐熱性很強，不易殺滅。因此在設計滅菌操作時，經常以殺死芽孢的溫度和時間為指標。為了確保徹底滅菌，實際操作中往往增加50％的保險系數。

2培養基滅菌(1)微生物高溫死亡動力學與滅菌的關系微生物受熱死亡過程的一級動力學反應：－dX/dt=kdX微生物濃度與滅菌時間成正比，濃度越高，滅菌時間越長。以殺死芽孢的溫度和時間為指標。確保徹底滅菌，實際操作中增加50％的保險系數。(2)培養基滅菌的操作方式分批滅菌操作，間歇滅菌,實罐滅菌：配制好培養基輸入發酵罐內，直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至發酵要求的溫度。特點：不需其他的附屬設備，操作簡便，手動。缺點：加熱和冷卻時間較長。營養成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產規模。分批滅菌的操作過程通入蒸汽：空氣管、夾套通入蒸汽。加熱升溫：70℃，取樣管、放料管通入蒸汽。維持保溫：120℃，罐壓0.1MPa，排氣。調節進汽和排氣量，維持30min。冷卻降溫：依次關閉排氣、進汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。連續滅菌操作高溫短時滅菌操作，連續。培養基在發酵罐外經過一套滅菌設備連續的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發酵罐內的工藝過程。加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個階段由不同的設備執行：加熱器，保溫設備，冷卻器。連續滅菌操作－流程圖

培養基與高壓蒸汽直接混勻，達到滅菌溫度（130－140℃）連續滅菌－操作過程配料：配料罐，配制培養基。預熱罐：定容和預加熱。70－90℃。加熱器：培養基與蒸汽混合，快速升到130－140℃。維持罐：維持滅菌時間,5－7分鐘。冷卻管：培養基經過冷卻水管冷卻。40－50℃。輸入滅菌的發酵罐中。連續滅菌的特點1）高溫快速滅菌工藝，營養成分破壞的少2）熱能利用合理，易于自動化控制；3）不適合粘度大或固形物含量高的培養基滅菌；4）增加了連續滅菌設備及操作環節，增加染菌幾率。5）對壓力要求高，一般為0.45-0.8MPa。

空氣除菌操作工藝發酵對空氣的要求好氧微生物需要氧氣供應，通入空氣。連續一定流量的壓縮無菌空氣。壓強：0.2-0.4MPa。空氣質量：相對濕度小于70％；比培養溫度高10－30℃；潔凈度100級。工業制備大量空氣的方法加熱滅菌：空氣在進入培養系統之前，一般需用空壓機以提高壓力，所以空氣熱滅菌時所需溫度的提高，可直接利用空氣壓縮時的溫度升高來實現.靜電除菌：靜電除塵是利用靜電引力來吸附帶電離子而達到除塵滅菌的目的。懸浮于空氣中的微生物、微生物孢子大多數帶有不同的電荷，沒有電荷的微粒進入高壓靜電場時則會被電離成帶電微粒，但對于一些直徑很小的微粒，它所帶的電荷很小，當產生的引力等于或小于氣流對微粒的拖帶力或微粒布朗運動的動量時，微粒就不能被吸附而沉降，所以靜電除塵對很小的微粒效率較低。介質過濾：是使空氣通過經高溫滅菌的介質過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質層中，而達到除菌的目的。空氣除菌原理空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。是依靠氣流通過濾層時，基于濾層纖維的層層阻礙，迫使空氣在流動過程中出現無數次改變氣速大小和方向的繞流運動，從而導致微生物微粒與濾層纖維間產生撞擊、攔截、布朗擴散、重力及靜電引力等作用，從而把微生物微粒截留、捕集在纖維表面上，實現了過濾。

（1）慣性沖擊滯留作用機理當微粒隨氣流以一定的速度垂直向纖維方向運動時，空氣受阻即改變運動方向，繞過纖維前進，而微粒由于它的運動慣性較大，未能及時改變運動方向隨主導氣流前進，于是微粒直沖到纖維的表面，由于磨擦粘附，微粒就滯留在纖維表面上。（２）攔截滯留作用機理

當氣流速度下降到一定值時，若微粒隨氣流慢慢靠近纖維時，受纖維所阻改變方向，繞過纖維前進，并在纖維的周邊形成一層邊界滯留區，滯留區的氣流流速更慢，當與纖維表面接觸時就被捕集。

（３）布朗擴散作用機理

直徑很小的微粒在很慢的氣流中能產生一種不規則的直線運動，稱為布朗擴散。（４）重力沉降作用機理

重力沉降是一個穩定的分離作用，當微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。（５）靜電吸附作用機理

懸浮在空氣中的微粒大多帶有不同電荷，這些帶電的微粒會受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。空氣過濾介質膜過濾介質：孔徑小于被截留微生物體積硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜，四氟乙烯、纖維素樹脂微孔濾膜。0.1-0.5um深層過濾介質：空隙大于被截留微生物體積。纖維狀或顆粒狀：棉花(50um)、玻璃纖維、活性炭過濾紙：超細玻璃纖維紙(1-1.5um)金屬燒結管：單根或幾十根甚至上百根金屬微孔濾管安裝在過濾器內。空氣滅菌工藝過程10.6發酵培養技術選擇合適的培養基；提供適宜的環境條件微生物發酵工藝過程的三個工段：種子制備接種發酵培養1種子制備種子的制備：種子的逐級擴大培養過程。獲得一定數量和質量的純種過程。孢子制備種子活化：將保存菌種接種在固體培養基上，在適宜條件下培養，恢復其固有生物特性。放線菌孢子：采用瓊脂斜面培養基。霉菌孢子：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養基。細菌：采用碳源有限而氮源豐富的配方。生產種子制備

搖瓶種子制備：母瓶、子瓶。種子罐種子制備：一級、二級、三級種子。種子罐級數：制備種子需逐級擴大培養的次數確定種子級數的因素:菌種生長特性及菌體繁殖速度：生長快，少發酵罐的容積：越大，多產物的品種及生產規模：越大，多所選用工藝條件：有利于生長的工藝，少發酵類型的定義:一級發酵：將孢子或菌絲接入直接發酵罐二級發酵：經過一級種子罐，再到發酵罐；谷氨酸生產三級發酵：二級種子擴大培養，經過二次種子罐，再接入發酵罐。青霉素生產四級發酵：三級種子擴大培養，經過三級種子罐，再到發酵罐。鏈霉素生產菌接種方式單種法：一個種子罐的種子接種一只發酵罐。雙種法：兩個種子罐的種子接種一只發酵罐。倒種法：從發酵罐中取出一定量發酵液，接種到另一個發酵罐。2培養技術A固體表面培養技術：Solidsurfaceculture原始，最早采用。B液體深層培養：Liquidsubmergedculture主要的發酵培養技術C高密度培養（highcelldensityculture）概念：菌體濃度（干重）至少達到50g/L以上的一種理想培養，發酵工藝目標和方向。優點:縮小發酵體積增加表達量成本低，生產率高。3發酵培養的操作方式A分批式操作；間歇式操作；不連續操作B流加式操作，補料－分批式操作C半連續式操作，反復分批式或換液培養D連續式操作，衡態操作E灌流式操作A分批式操作概念：培養液一次性裝入發酵罐，一次性接種，經過一段時間培養，一次性卸出全部培養物。特點：非衡態過程－發酵體系的組成（基質、產物及細胞濃度）都隨發酵時間而變化。缺點：開始時基質濃度很高，到中后期，營養物濃度很低，產物濃度很高，對發酵不利。輔助時間：清洗罐，裝料、滅菌，時間長。B流加式操作概念：裝入大部分培養液，一次性接種，在培養過程中連續不斷補充新培養基，但不取出培養液。特點：流加能源和碳源物質及氨水等。克服了批式的缺點，使生長和生產保持適宜水平。缺點：整個發酵體積不斷增加。C半連續式操作概念：培養液一起裝入發酵罐，一次性接種。間歇取出部分發酵培養物（帶放），同時補充同等數量的新培養基；然后繼續培養，直至發酵結束。特點：發酵罐內的培養液總體積保持不變使生長和生產保持適宜水平。缺點：喪失部分前體，喪失部分菌體，利于非生產菌突變株的生長D連續式操作概念：培養液一起裝入發酵罐，接種后培養過程中，不斷補充新培養基,同時取出包括培養液和菌體在內的發酵液，直至發酵結束。特點：恒定狀態的發酵，發酵罐內體積及其物系的組成將不隨時間而變。培養基連續穩定流加；產物連續穩定收獲；提高菌體密度；自動化。缺點：時間長，雜菌污染、突變機會增多。E灌流（注）式操作概念：培養液與菌體一起裝入發酵罐，菌體培養過程中，不斷補充新培養基，取出部分條件培養基，菌體仍然滯留罐內。特點：除去有毒害的代謝物，補充營養物質。10.7發酵培養工藝控制微生物發酵生產水平取決于:生產菌種性能與合適的環境條件發酵過程各種參數處于不斷變化狀態關鍵在于過程檢測與控制檢測儀器與主要參數原位傳感器：pH，溶氧，溫度，壓力在線儀器：尾氣分析儀離線儀器：基質、產物濃度生物學參數：菌體濃度，形態，雜菌物理參數：溫度，壓力，攪拌，粘度化學參數：基質濃度，pH，溶解氧，尾氣，補料，消泡1生物學檢測主要的參數與控制（1）細胞形態鏡檢：顯微鏡檢測，染色，光學、熒光，電鏡應用：是否污染，發酵過程狀態，菌種的真實性。（2）菌體濃度概念：單位體積發酵培養液內菌體細胞的含量。應用：決定適宜補料量、供氧量等，以得到最佳生產水平。（3）臨界菌體濃度控制概念：攝氧速率與氧傳遞速率平衡時的菌體濃度菌體濃度超過此濃度，抗生素的生產速率會迅速下降。菌體遺傳特性與發酵罐氧傳質特性的綜合反映。2物理參數的檢測與控制（1）溫度的檢測與控制發酵溫度概念:發酵中的所維持溫度在生長和生產的最適溫度范圍內測定：熱電阻等熱敏原件測定，溫度計上讀出。發酵熱（fermentationheat）：產生熱與散失熱之差產生熱：生物熱和攪拌熱散失熱：蒸發熱、顯熱和輻射熱。Q發