血清谷—丙轉氨酶活性的測定（改良賴氏法）【目的要求】1.掌握血清谷丙轉氨酶活性測定的基本原理。2.熟悉血清谷丙轉氨酶活性測定的具體操作方法。3.了解血清谷丙轉氨酶活性測定的臨床意義。【實驗原理】血清中的谷-丙轉氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的條件下，可催化基質（底物）液中的丙氨酸與α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：生成的丙酮酸可與起終止和顯色作用的2,4二硝基苯肼發生加成反應，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，進而在堿性環境中生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺在一定范圍內與丙酮酸的生成量，亦即與ALT活性的高低成正比關系。據此與同樣處理的丙酮酸標準液相比較，便可算出或通過標準曲線查出血清中ALT的活性。

盡管基質液中余下的a-酮戊二酸同樣可生成紅棕色苯腙硝醌化合物而影響測定結果，但因其量不多，加之對505nm的吸光度遠不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物強，尤其用標準曲線作測定時，所用的酶活性單位通過卡門氏分光光度速率法矯正，擯棄了賴氏法一些固有弊端，結果比其他比色法準確。故衛生部臨檢中心建議國內無條件使用連續監測法的單位使用賴氏法。1981年全國常規生化檢驗方法學術討論會認為賴氏法測定ALT活性較為合理，全國肝炎協作會議也建議統一使用改良賴氏法。【方法評價】ALT活性測定主要有兩類。一是卡門氏（Karman）分光光度法，測定的是酶促反應速率。其原理如下：由于NADH在波長340nm處有特異吸收峰，因此ALT的活性可通過NADH的減少量，亦即通過340nm吸光度的減少量間接作出定量測定。這一方法特異性、準確性高。但是此法除要加入待測酶ALT的底物外，還需要加入指示酶LDH及其輔酶NADH，又需用紫外分光光度計，因此不易為一般臨床化驗室推廣。二是比色測定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun法）和賴氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、試劑、操作步驟及作用溫度等完全相同。不同之處在于作用時間：King法60min，Mohun法和Reiman法30min。因此它們的單位定義和標準曲線制備也不同。King法單位定義是：每1ml血清在37℃條件下與底物作用60min，生成1μmol丙酮酸稱為一個單位。Mohun法單位定義是：每毫升血清在pH=7.4，37℃條件下與底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸為1單位。賴氏法沒有制定自身的單位定義，而是以實驗數據套用速率法的卡門氏單位作表示的。1個卡門氏單位的定義是：在溫度25℃，pH7.4，波長340nm，光徑1cm的條件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的轉氨酶活性。可見卡門氏單位不是用物質的量濃度，而是用物質的吸光度表示酶的活性單位的。若將卡門氏單位的定義條件代入國際單位計算公式，即得卡門氏單位與國際單位的換算關系：1卡門氏單位=0.4821IU/L(25℃)，便可將卡門氏單位兌換成國際單位。改原賴氏法的反應溫度(40℃改為37℃)和底物濃度(改為低濃度)的改良賴氏法，對卡門氏單位的科學套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其結果與速率法較為一致，能較好反映酶的真實活性。由于賴氏法設計的底物濃度,如a-酮戊二酸不足，反應速度只能達到最大速度的65%；顯色劑2,4-二硝基苯肼的用量只及反應液中酮酸濃度的一半；保溫30min的酶促反應后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在著無法人為控制的競爭顯色的幾率問題，如此等等，使賴氏法的重現性較差，在測量精度上仍與連續監測法相差甚大。【臨床意義】肝細胞中含ALT最豐富，因此當肝臟疾病致肝細胞受損傷時，ALT即大量釋放入血液，致使血清中ALT活性增高。測定ALT是檢查肝功能的重要指標之一。ALT顯著增高見于各種急性肝炎及藥物中毒性肝細胞壞死，中等程度增高見于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，輕度增高則見于阻塞性黃疸及膽道