專業：園藝姓名：尚靜專業：園藝姓名：尚靜學號：3140100506日期：2015年10月26日地點：生物實驗中心裝訂線課程名稱：生物化學實驗（甲）指導老師：方祥年成績：__________________實驗名稱：蛋白質含量測定、蔗糖酶活力測定及純化方案的評價實驗類型：同組學生姓名：沈杭寧、董文婷、蔣天佑一、實驗目的和要求（必填） 二、實驗內容和原理（必填）三、實驗材料與試劑（必填）四、實驗器材與儀器（必填） 五、操作方法和實驗步驟（必填）六、實驗數據記錄和處理 七、實驗結果與分析（必填）八、討論、心得一、實驗目的和要求1、學習Folin-酚法測定蛋白質含量的原理和方法2、掌握分光光度法制作標準曲線，準確測定未知樣品的蛋白質含量3、掌握分光光度計的使用方法4、掌握酶活力測定的基本原理和方法5、學習酶的比活力的計算二、實驗內容和原理1.Folin-酚法測定蛋白質含量Folin-酚測定法是在雙縮脲反應的基礎上發展起來的，Folin-酚試劑是由甲、乙兩種試劑組成的。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅和酒石酸鉀鈉組成，在堿性條件下蛋白質中的肽鍵與酒石酸鉀鈉銅鹽起作用，生成紫紅色絡合物；乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成，在堿性條件下，銅-蛋白質絡合物以及蛋白質中的酪氨酸殘基（酚基）和色氨酸還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（乙試劑）產生深藍色（鉬藍和鎢藍的混合物），其色澤深淺與蛋白質含量成正比。可用500nm波長比色測定，適于測定蛋白質含量0.05～0.5g/L.2、3,5-二硝基水楊酸比色法蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2－糖苷鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol還原糖。還原糖的測定有多種方法，例如：納爾遜－索模吉（Nelson-Smogyi）試劑比色法，斐林試劑法等。本實驗采用3.5－二硝基水楊酸法測定還原糖的含量。其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內還原糖的量和反應液的顏色深度成正比。因此可利用分光光度計在520nm進行比色測定，求得樣品中的含糖量。蔗糖酶活力單位(u)：蔗糖酶在室溫(25℃）,pH4.5的條件下，每分鐘水解產生1μmol葡萄糖所需的酶量(ml)。蔗糖酶比活力的計算：酶的比活力——為每毫克蛋白質所具有的酶活力單位數，一般用酶活力單位/mg蛋白質表示（比活力＝活力單位/mg蛋白）。酶的比活力在酶學研究中用來衡量酶的純度，對于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。利用比活力的大小可以用來比較酶制劑中單位質量蛋白質的催化能力，是表示酶的純度高低的一個重要指標。注：*葡萄糖（分子量：180.1572）和果糖（分子量：180.16）為同分異構體。三、實驗材料與試劑1、實驗材料蔗糖酶提取的各步分離純化樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ?？筛鶕悠啡芤旱牡鞍踪|含量高低作適當的稀釋。2、實驗試劑(1)Folin-酚測定法： ①標準蛋白質溶液：0.5g/L牛血清白蛋白 ②Folin-酚試劑（甲試劑、乙試劑）(2)3,5-二硝基水楊酸比色法： ①1g/L葡萄糖標準溶液(葡萄糖相對分子量198.17） ②5％蔗糖溶液 ③0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5 ④3,5－二硝基水楊酸試劑（DNS）四、實驗器材與儀器（1）恒溫水?。?0℃、100℃）（2）可見光分光光度計、1cm玻璃比色皿（3）試管、試管架（4）移液管（5）微量移液器：200μl、1000μl五、操作方法和實驗步驟1.Folin-酚測定法：（1）制備Folin-酚法蛋白質標準曲線取6支試管，編號1－6，按表1順序依次加入各種試劑，并在分光光度計于500nm處測定光吸收值（A500nm值）。（2）各步分離純化的蔗糖酶蛋白測定由于蔗糖酶提取、分離純化的各個樣品的蔗糖酶蛋白質含量較高，因此在測蔗糖酶提取分離純化樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蔗糖酶蛋白質含量以前，可根據各樣品溶液的蔗糖酶蛋白質含量高低不同作適當的稀釋，以測定蔗糖酶蛋白質含量A500nm值在蛋白質含量標準曲線范圍以內為宜。取13支試管，編號1～13，按表2依次加入各種試劑，并在分光光度計于500nm處測定光吸收值（A500nm值）。（3）繪制標準曲線并計算繪制標準曲線：以光吸收值（A500nm）為縱坐標，標準蛋白質含量（mg/L）為橫坐標，在坐標紙上繪制蛋白質標準曲線。計算：蔗糖酶提取分離純化的樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀釋溶液的光吸收值（A500nm），查蛋白質標準曲線得蔗糖酶蛋白含量，再進行樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最終蔗糖酶蛋白含量的計算。2.3,5-二硝基水楊酸比色法：（1）標準曲線的制作表31234567葡萄糖含量(umol)01.01.52.02.53.03.51g/L葡萄糖標準溶液（ml）00.20.30.40.50.60.7H2O（ml）21.81.71.61.51.41.33.5－二硝基水楊酸(ml)1.01.01.01.01.01.01.0將各管溶液混勻后，在100℃恒溫水浴加熱5min，取出立即用冷水冷卻至室溫蒸餾水（ml）7777777將各管溶液混勻A520nm按照表3加樣，以葡萄糖含量（umol）為橫坐標，A520值為縱坐標，制作葡萄糖濃度－吸光值標準曲線。（2）蔗糖酶的酶活力測定表4樣品空白I(200倍稀釋)Ⅱ(200倍稀釋)Ⅲ(200倍稀釋)Ⅳ(100倍稀釋)編號123456789101112130.2mol/L乙酸緩沖液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5蒸餾水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5蔗糖酶液(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.55％蔗糖溶液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保溫時間立即混勻后，50℃保溫10min3.5－二硝基水楊酸試劑(ml)1111111111111在100℃恒溫水浴中加熱5min蒸餾水7777777777777混勻A520根據測得的光吸收值（A520），查標準曲線得蔗糖酶活力，再進行樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最終蔗糖酶活力的計算。六、實驗數據記錄和處理1.Folin-酚測定法：制備Folin-酚法蛋白質標準曲線表5Folin-酚法蛋白質標準曲線數據記錄試管號123456A500nm00.1650.2700.4190.5130.639Folin-酚法蛋白質標準曲線（2）各步分離純化的樣品蛋白含量測定表6各步分離純化的蔗糖酶蛋白測定樣品空白I(1:20稀釋)Ⅱ(1:10稀釋)Ⅲ(1:5稀釋)Ⅳ(1:1稀釋)編號12345678910111213A500nm00.1100.2740.6240.2650.4280.9130.1820.6661.0390.3010.7631.492蔗糖酶蛋白含量（mg）00.07110.20190.48110.19470.32470.71160.12850.5146—0.22340.5919—每ml稀釋液蛋白含量(mg)01.42201.00950.96223.89401.62351.42322.57002.5730—4.46802.9595—每ml稀釋液蛋白含量平均值(mg)01.13102.31362.57153.71382.3,5-二硝基水楊酸比色法：（1）制備3,5-二硝基水楊酸法標準曲線表73,5-二硝基水楊酸法標準曲線數據記錄試管號1234567葡萄糖含量(umol)01.01.52.02.53.03.5A520nm00.2450.3990.5180.8771.095數值過大舍去3,5-二硝基水楊酸法標準曲線蔗糖酶的酶活力測定表8蔗糖酶酶活力測定數據記錄樣品空白I(200倍稀釋)Ⅱ(200倍稀釋)Ⅲ(200倍稀釋)Ⅳ(100倍稀釋)編號12345678910111213A520nm00.3181.4951.6680.2361.3391.6840.3761.5621.7300.6431.7091.793葡萄糖含量（umol）01.1080——0.8838——1.2665——1.9964——蔗糖酶活力單位(u)00.1108——0.0884——0.1267——0.1996——稀釋液中蔗糖酶活力(u/ml)02.216——1.768——2.534——3.992——稀釋液中蔗糖酶活力平均值(u/ml)02.2161.7682.5343.992七、實驗結果與分析結果：表9蔗糖酶各步純化樣品的純度與酶活力比較體積(ml)蛋白濃度(mg/ml)總蛋白(mg)活力(u/ml)總活力u比活力u/mg樣品Ⅰ20.022.620452.400443.28864.019.6樣品Ⅱ16.523.136381.744353.65834.415.3樣品Ⅲ9.512.858122.151506.84814.639.4樣品Ⅳ16.13.713859.792399.26427.12107.5分析：由實驗結果可得，隨著逐漸的分離提純，樣品Ⅰ到樣品Ⅳ的蛋白濃度降低，總蛋白含量也在降低，總活力也有所降低，而比活力則在逐步提高，表明蔗糖酶濃度在逐步提高，基本達到將蔗糖酶粗提純的目的。樣品Ⅱ的數據不是很符合上述結論，猜測與以下因素有關：每次實驗間隔時間較長，酶活性及蛋白質有所損失，致使樣品Ⅱ的數據存在問題。樣品Ⅳ的比活力較高，表明蔗糖酶純度較高，可能與做離子分析柱層析分離純化蔗糖酶這一步時，裝得的層析