第二章：菌種的來源微生物的特性及工業微生物的要求一些工業化產品生產菌種的特點自然界中有目的微生物分離的原則菌種選育、分子育種第二章菌種的來源第一節微生物的特性及工業微生物的要求一、微生物的特性

有些微生物能在厭氧的條件下生長

有些微生物能夠利用簡單的有機物和無機物滿足自身的生長

有些微生物能進行復雜的代謝

有些微生物能利用較復雜的化合物

有些微生物能在極端的環境下生長第二章菌種的來源二：工業化菌種的要求

能夠利用廉價的原料，簡單的培養基，大量高效地合成產物

有關合成產物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強

遺傳性能要相對穩定

不易感染它種微生物或噬菌體

產生菌及其產物的毒性必須考慮（在分類學上最好與致病菌無關）

生產特性要符合工藝要求第二章菌種的來源放線菌（鏈霉素四環素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產芽孢的細菌植物或動物來源一、抗生素生產有關的微生物抗生素是次級代謝產物，需要生物體進行復雜的代謝，目前發現的生物來源如下：第二節已工業化產品生產菌的介紹第二章菌種的來源二、氨基酸生產有關的微生物代謝控制發酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產物，這種發酵形象地稱為代謝控制發酵，最早在氨基酸發酵中得到成功應用。50,60年代以氨基酸發酵為代表的代謝控制發酵，是發酵工業發展歷史上的一個轉折點：第二章菌種的來源HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調節機制

HT:高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶第二章菌種的來源氨基酸生產菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發酵的菌種：其它氨基酸生產菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節桿菌屬或小桿菌屬的棒型細菌常規菌種一般也是以谷氨酸生產菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌第二章菌種的來源三、食品酶制劑生產有關的微生物開發一個新酶，都要經過一系列研究的毒理試驗。關于食品用酶，美國需要得到FDA的批準。目前已同意使用的僅僅少數微生物能用于生產食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌第二章菌種的來源三、常用的基因表達系統(一)原核生物：大腸桿菌(1977年Boyer)、枯草牙胞桿菌沙門氏菌

生長迅速、蛋白產量高;

表達蛋白的純化、分離及分析快速；

外源基因的導入相對容易；

已建立了整套表達理論及技術.第二章菌種的來源(二)真核細胞表達系統

酵母(既是微生物又是真核細胞)

生長迅速，營養要求不高，易培養；

安全性好；

比哺乳動物細胞操作簡單；

具有一定的修飾蛋白的能力。第二章菌種的來源

中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）表達系統

具有準確的轉錄后修飾功能；

具有產物胞外分越功能，便于下游產物分離純化；

具有重組基因的高效擴增和表達能力；

具有貼壁生長特性，也可進行懸浮生長；

CHO很少分泌自身的內源蛋白。第二章菌種的來源微生物（包括動、植物細胞）幾乎可以生產我們所需的一切產品，但是涉及到工業化生產對于某一種特定的產品，只有特定的微生物才具有大量表達的潛力。問題：生產抗生素的微生物能不能用于生產氨基酸？禮來(Elililly),花了10年的時間從40萬株微生物中，發現了三種有潛力的新抗生素。例：第二章菌種的來源第三節自然界中有目的微生物分離的原則一、菌種分離的一般過程土樣的采取→預處理→培養→菌落的選擇→產品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續的操作中使這種可能性實現目的：高效地獲取一株高產目的產物的微生物問題：第二章菌種的來源二、采樣時要注意的問題

氣候、水分、空氣

來源要廣

結合產品的特點

標簽：地點、時間、氣候等第二章菌種的來源富集的三種方案：

定向培養:采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進行培養。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優勢，使篩選變得可能。

當不可能采用定向培養時，則可設計在一個分類學中考慮，

不能提供任何有助于篩選產生菌的信息，這時只能通過隨機分離的辦法第二章菌種的來源定向培養的方法物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2（P31）但主要是通過培養的方法第二章菌種的來源定向培養的富集方法1、底物2、pH條件3、培養時間4、培養溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養（固體、液體；分批連續）后使目的微生物在種群中占優勢。第二章菌種的來源四、菌落的選出

從產物角度出發在培養時以產物的形成有目的的設計培養基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素（P35）

從形態的角度

菌落的外觀形態，是微生物的一個重要表征。如多糖產生菌在適當的培養基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。第二章菌種的來源實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選（國家七五攻關項目）采樣（造紙廠）→80度30分鐘處理文獻:產生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導型↓第二章菌種的來源例：醛肟水解酶的篩選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培養物，補充新鮮培養基不斷分析樣品，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離條菌落第二章菌種的來源五、目的微生物富集方法的研究進展

分子生物學的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標產物的篩選方面發揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術等

目前土壤中能夠培養的微生物不到總數的1%。微生物的多樣性及資源的開發仍然是今后若干年的研究重點。

2002,陳文新（科學院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81第二章菌種的來源第四節菌株選育、分子改造目的

提高生產能力

提高產品質量

開發新產品

解決生產實際問題

防止菌種退化第二章菌種的來源方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易錯PCR、同序法DNAShuffling等第二章菌種的來源自然狀態下，堿基對發生自然突變的機率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產上所不希望看到的，表現為菌株的衰退和生產質量的下降，這種突變成為負突變。另一種是我們生產上希望看到的，對生產有利，這種突變成為正突變。一、自然選育第二章菌種的來源自然選育在工業生產上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩產高產的重要措施?；貜屯蛔儯焊弋a菌株在傳代的過程中，由于自然突變導致高產性狀的丟失，生產性能下降，這種情況我們稱為回復突變問題：高產菌株是正突變高，還是負突變高？第二章菌種的來源自然選育操作步驟：一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態的觀察)發酵試驗第二章菌種的來源二、誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發基因突變進行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學：硫酸二乙酯，亞硝基胍{第二章菌種的來源（二）、誘變劑處理過程中幾個有關的問題

化學誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發菌株的選擇（一）、誘變劑的作用原理（略）壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH第二章菌種的來源（三）、誘變育種的一般步驟(p83)（四）、篩選的方法

隨機篩選

形態

理性化篩選從產物形成的生理生化途徑著手，進行有的放矢的篩選。如結構類似物抗性、營養缺陷型等，篩選而產生的這些特性，稱為遺傳標記。結構類似物：在化學和空間結構上和代謝的中間物（終產物）相似，因而在代謝調節方面可以代替代謝中間物（終產物）的功能，但細胞不能以其作為自身的營養物質。第二章菌種的來源HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節機制

HT:高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結構類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養缺陷型：如Thr缺陷型第二章菌種的來源黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l第二章菌種的來源三、基因的直接進化(directedevolution)

突變基因突變庫的建立篩選基因突變庫的篩選基因復制與遺傳步驟：

在分子水平上，對目標基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標蛋白的性能。第二章菌種的來源主要應用：酶學性能的提高:pH

溫度

有機溶劑生理環境→工業催化環境

底物專一性第二章菌種的來源脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學拆分選擇性(%)231577581905次錯位PCR2次定點突變Reetz(1997)Liebeton(2000)第二章菌種的來源第二章菌種的來源定點突變第二章菌種的來源錯位PCR第二章菌種的來源DNAShuffling:指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進行有性重組(SexualRecombination)。第二章菌種的來源XXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXX

FragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling第二章菌種的來源項目進化速度進化對象進化周期影響對象