1第九章細菌類疫苗2細菌類疫苗定義：用細菌、支原體、螺旋體或其衍生物制成，進入人體后使機體產生抵抗相應細菌能力的生物制品——細菌類疫苗種類：（1）減毒活疫苗（2）滅活疫苗（3）亞單位疫苗或成分疫苗第一節概述3（3）亞單位疫苗或成分疫苗主要指在細菌培養液中提取，用化學方法脫毒的類毒素，如破傷風類毒素、白喉類毒素。成分疫苗：主要指從莢膜細菌純化的細菌多糖疫苗，其誘導機體產生的抗體可抵抗莢膜菌的感染。4附表：目前用于人群的細菌性疫苗卡介苗百日咳疫苗腦膜炎球菌疫苗傷寒疫苗精制破傷風疫苗（類毒素）霍亂弧菌疫苗痢疾疫苗用法：i.d.,s.c.,d.s.,i.m.,p.o.5基本流程菌液佐劑+乳化分裝和保存原料配置滅活菌液滅活第二節細菌滅活疫苗6滅活疫苗的生產工藝與檢定菌種檢定與制備1）菌種檢定：包括培養特性、血清學特性、毒力試驗、抗原性試驗、免疫力試驗制苗用菌種多數為毒力強、免疫原性優良的菌株，通常使用1-3個品系，均由中國藥品生物制品檢定所或中國獸藥監察所傳代、鑒定、凍干保存和供應。各種用于制造菌苗的菌種應按規定定期復壯，并進行形態、培養特性、菌型、抗原性和免疫原性鑒定，合格菌種準許用于制苗。7滅活疫苗的生產工藝與檢定菌種檢定與制備2）菌種制備菌種啟開：接種于適宜的培養基上，37±1°C一代培養；擴量轉種：一代菌種的擴量接種，于37±1°C二代培養。將經鑒定符合標準的菌種接種于菌苗生產規程中所規定的培養基進行增殖培養，經純粹檢查、活菌計數達到標準后即為種子液，用于菌苗生產。種子液通常保存于2-8

C冷暗處，不得超過規程規定的使用期限。82.生產方法（1）固體培養法：克氏瓶、茄形瓶（2）液體靜置培養法、液體深層通氣培養法3.細菌采集（1）固體培養法采集時逐瓶檢查，污染雜菌者廢棄。（2）液體培養法采集時應做純菌試驗，確定無雜菌生長。94.殺菌、脫毒（滅活）殺菌劑對疫苗的質量至關重要，通常根據細菌的特性加入最有效的滅活劑，我國多用甲醛，終濃度不超過1%。殺菌檢查：取樣接種于不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基、瓊脂斜面及堿性瓊脂斜面各一支，37℃培養5d，應無本菌生長。表幾種滅活菌苗的滅活方法

105濃縮

為提高某些滅活菌苗的免疫力，在培養過程中采取提高菌數的基礎上，再通過濃縮方法達到目的。

常用的濃縮方法：氫氧化鋁膠吸附沉淀法離心沉降法羧甲基纖維沉淀法

以上方法可使菌液濃縮一倍以上。

此外，有些細菌在生長過程中產生分子量小的可溶性抗原（如豬丹毒桿菌產生的糖蛋白）也可經氫氧化鋁吸附濃縮；將破傷風脫毒液按鹽酸—食鹽法處理，以作進一步精制成提純破傷風類毒素。116.原液檢定及保存：濃度測定：按“中國細菌濁度測定標準”測定濃度鏡檢：涂片染色，至少觀察10個視野，應菌型典型，無雜菌凝集試驗：血清型定型凝集試驗，應呈陽性反應無菌試驗:需氧菌、厭氧菌及真菌試驗應陰性免疫力試驗：原液保存：（2-8℃，3-4年有效）127.配苗及分裝由于滅活菌苗所用的佐劑不同，所以配苗方法也不相同。

氫氧化鋁菌苗：可在加入甲醛滅活的同時，按比例加入氫氧化鋁膠配制；也可在菌液經甲醛滅活后再按比例加入氫氧化鋁膠配苗。有的廠油佐劑菌苗的配制程序為：于滅菌的油乳劑135m110號白油、11.4m1Span-85、3.6mlTween80混合液中，在邊攪拌下加入等量甲醛滅活菌液配制。配苗和分裝：應充分混勻，及時塞塞、貼簽或印字8.成品檢定按規程進行13常用滅活細菌疫苗1.霍亂疫苗（1）霍亂簡介由霍亂弧菌引起的烈性腸道傳染病，霍亂弧菌在小腸分泌霍亂毒素（choleratoxin），引起腹瀉及其他癥狀。（2）抗原鞭毛抗原：不耐熱，無分型意義，有免疫保護作用。菌體抗原：主要成分為脂多糖（LPS），耐熱，根據其抗原決定基可分為200多鐘血清型，O1和O139為流行血清型。14（3）目前最常用的霍亂疫苗口服霍亂滅活全菌體+重組霍亂毒素B亞單位重組霍亂毒素B亞單位（sBS）具有黏膜免疫佐劑特性，該疫苗安全有效且無明顯不良反應，保護力持久。152.傷寒疫苗（1）概述由傷寒沙門桿菌引起的急性全身感染，患者出現高熱，胃腸炎，敗血癥等。含有三類抗原:LPS，莢膜多糖(vi)，鞭毛抗原，耐藥性比較嚴重。（2）生產工藝與檢定全菌體死疫苗分三種，按殺菌劑不同可分為丙酮滅活苗，加溫加酚滅活苗，甲醛滅活苗。16①菌株我國現用兩個菌株生產疫苗：國際通用Ty2株國內代表株②培養基及培養方法采用馬丁瓊脂、肉湯瓊脂或其他經批準的培養基，主要采用固體培養法，也可進行發酵生產接種后35~37℃培養18~24h。17③成品檢定鑒別試驗、外觀、化學檢定、無菌試驗、異常毒性試驗、菌形及純度檢查④疫苗規格及有效期每安瓿瓶5ml，每人用劑量含傷寒菌6×107~3×108，2~8℃避光保存和運輸，有效期1.5年。18（3）傷寒Vi多糖疫苗早期乙酸處理Vi多糖，抗原性明顯降低，經溴化-16-烷基-3-甲基氨處理Vi多糖，得到的非變性多糖可顯示較好的免疫原性，但是對2歲以下兒童無效，且多糖是T淋巴細胞非依賴性抗原，不具有加強免疫記憶的作用，蛋白質-Vi多糖結合疫苗正在研制當中。莢膜（Vi）抗原:即莢膜多糖（CPS）,是傷寒桿菌細胞外壁的一種莢膜抗原,Vi抗原與其致病性有關Vi來源于毒力的縮寫。19（4）傷寒Ty21a口服減毒活疫苗德國學者將野生型菌株Ty2經化學突變劑亞硝基胍處理而獲得的突變株，在提供較高免疫保力的同時具有很高的安全性。203.百日咳疫苗1）概述由百日咳桿菌引起的急性呼吸道傳染病，主要侵犯嬰幼兒，全病程較長，可持續幾個月，故名百日咳。百日咳菌可分四種相變：Ⅰ相菌毒力最強，有免疫原性；Ⅳ相毒力消失，無免疫原性；Ⅱ、Ⅲ相菌介于Ⅰ、Ⅳ之間。222）百日咳死疫苗的生產工藝與檢定①菌種生產用菌種采用百日咳Ⅰ相含1型、2型、和3型凝集原的菌株。②培養方法固體培養采用半綜合碳瓊脂培養基，也可發酵生產。23③原液檢定濃度測定、鏡檢、血清學試驗、無菌試驗、特異性毒性試驗、效價測定。④原液保存2~8℃，有效期3年⑤配合稀釋及分裝按原液中具有1、2和3型菌株的配比混合，也可制成百白破三聯疫苗（百日咳、白喉、破傷風）24弱毒菌種多系凍干品，由中國藥品生物制品檢定所或中國獸藥監察所傳代、鑒定、保存與分發，少數由國家指定單位鑒定、保存與供給。菌種使用前應按規程規定進行復壯、挑選，并作形態、特性、抗原性和免疫原性鑒定，符合標準后方可用于制苗。將檢定合格的菌種接種子于規定的培養基，按規定的條件增殖培養，經純粹檢查及有關的檢查合格者即可作為種子液。種子液通常在0～4

C可保存2個月，在保存期內可作為菌苗生產的批量種子使用。第三節細菌減毒活疫苗

一、生產工藝與檢定（一）菌種與種子25按1%～3%量將種子液接種于培養基，然后依不同菌苗要求進行培養。如豬丹毒弱毒菌須在在深層通氣培養中加入適當植物油作消泡劑，通入過濾除菌的熱空氣進行培養制造菌液如人用炭疽活疫苗、卡介苗經固體表面培養完成后須按規定要求將菌苔洗下制成菌液菌液于0～4

C暗處保存，待抽樣經純粹、活菌數等檢查合格后使用。（二）菌液培養26

經檢驗合格的菌液，按規定比例加入保護劑配苗，充分搖勻后隨即進行分裝，分裝量必須準確。分裝好的菌苗迅速送入凍干柜進行預凍、真空干燥，凍于完畢后立即加塞、抽空、封口，移入冷庫保存，并由質檢部門抽樣檢驗。

（四）配苗與凍干

為提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可進行濃縮，以提高單位活菌數，常用的依縮方法有吸附劑吸附沉降法、離心沉降法等，如于豬丹毒菌液內加入0.2%～0.25%羧甲基纖維素(CMC)進行濃縮，也可用離心沉淀濃縮。濃縮菌液應抽樣作純粹、活菌數等檢查。（三）濃縮27流程圖1——細菌疫苗制造工藝流程蛋白質、肉浸液等原料培養基細菌分離菌種弱毒菌種配置、滅菌鑒定減毒檢驗配制滅菌檢驗配制滅菌原料佐劑滅活菌液配苗、乳化滅活疫苗培養菌苗原液配苗活疫苗保護劑菌液分裝、凍干分裝滅活原料活化種子2829二、常用細菌減毒活疫苗

炭疽疫苗

結核疫苗

鼠疫疫苗1、炭疽疫苗1）概述：定義：由炭疽桿菌引起的人畜共患的一種急性傳染病。特點：潛伏期3-5d。臨床表現為皮膚、肺部、腦膜和腸道等處的急性感染。臨床分型：①體表感染型②消化道感染型③呼吸道感染型30

2）炭疽菌的病原學①革蘭氏陽性，個體最大的桿菌之一，呈竹節狀，無鞭毛，在機體內或特殊培養條件下能形成莢膜。②營養要求不嚴，需氧，最適溫度34~37℃炭疽桿菌的營養細胞抵抗力不強，芽孢抵抗力強，過氧乙酸、高錳酸鉀、和甲醛對芽孢的殺滅力較強。31③抗原菌體抗原：多糖組分，耐熱性強。莢膜抗原：由質粒決定，可以抵抗細胞的吞噬作用，引起感染，對動物沒有免疫保護力，不能作為疫苗。毒素抗原：水腫因子（EF）；致死因子（LF）；保護性抗原（PA）；單獨組分無毒性，成對結合才能獲得毒素活性。323）炭疽疫苗（1）目前人用炭疽疫苗①減毒活疫苗②鋁膠培養上清液疫苗（2）炭疽疫苗的生產工藝與檢定①生產用菌株人、獸用的炭疽活疫苗生產均采用無莢膜具毒素（cap-tox+）菌株，我國采用的的A16R菌種均由藥品生物制品檢定所分發。33②培養及收獲生產用培養基采用牛肉汁瓊脂或其他批準培養基③半成品配置及分裝用滅菌的50%甘油將原液稀釋成每ml含菌數4×109④成品檢定鑒別試驗、外觀、純菌試驗、特異性毒性試驗活菌數測定、濃度測定、效力測定34⑤疫苗規格及有效期安瓿瓶裝，10人份含菌2×109，2~8℃避光保存運輸，有效期兩年。（3）目前人用炭疽疫苗的缺點①毒力不穩定②采用劃痕接種，免疫效果不均一③副反應較大④免疫保護力持續時間比較短352、結核疫苗病原菌為結核桿菌，能引起人畜共患結核病（1）流行概況全世界約1/3人口感染；每年約1600萬人患病，其中300多萬人死于結核病。中國治療難題：①發現率低；②無法接受正規治療或沒錢治療；③耐藥性36（2）傳染與傳播方式主要由呼吸道傳染，少數由消化道和皮膚粘膜的損傷處侵入。傳播方式：①飛沫傳染②痰液傳染③食物傳染④接觸傳染37（3）結核桿菌的潛伏和復燃結核桿菌類脂質等成分能對抗溶酶體中酶的破壞作用，使細菌在巨噬細胞內繁殖，導致巨噬細胞裂解死亡，病狀擴散至鄰近淋巴結，形成原發感染灶，當機體抗感染力較強時，淋巴結病灶逐漸纖維化和鈣化，此時病灶內的結核桿菌處于休眠期，并潛伏下來，幾年或十幾年后，結合桿菌可以重新復燃，引起成年人肺結核。38（4）結合桿菌抗藥性伴隨著結核病回升的另外一個問題是抗藥性的產生，多重抗藥性的發生率也越來越高，研制和開發有效的結合新疫苗勢在必行。392）結核桿菌的病原學①革蘭氏陽性，含分枝酸，具有抗酸性，胞壁含大量脂質，有較強的抵抗力②滅菌方法③具有免疫佐劑活性403）結核疫苗——卡介苗的生產工藝與檢定卡介苗（BCG）是牛型結合桿菌經培養后，收集菌體，加入穩定劑凍干后制成的，用于預防結核病①菌種卡介菌D2PB302菌株②培養和收集生產用培養基采用蘇通馬鈴薯培養基、膽汁馬鈴薯培樣基或液體蘇通培養基，搜集菌膜壓干，低溫研磨，加入穩定劑，制成原液。41③半成品配置及凍干用特定的保護劑稀釋成半成品，無菌分裝到安瓿瓶內④成品檢定鑒別試驗、外觀、溶解時間、水分、純菌試驗、無有毒分枝桿菌試驗、活菌計數、效力測定⑤疫苗規格及有效期10人份含卡介菌0.4~0.6mg，2~8℃避光保存運輸，有效期一年。42（4）新型結核疫苗的研究方向①以BCG為載體的基因工程結核疫苗②營養缺陷型結核減毒活疫苗（牛型/人型）③結核亞單位疫苗④結核DNA疫苗3、鼠疫疫苗（1）概述：鼠疫是由鼠疫桿菌引起的自然疫源性烈性傳染病。主要以“鼠→蚤→人”為主要傳播方式。43（2）鼠疫桿菌的病原學①鼠疫桿菌屬腸桿菌科，耶爾森氏菌屬。革蘭染色陰性短小桿菌。有莢膜，無鞭毛，無芽胞。②抗原和免疫原性44（3）鼠疫疫苗的生產工藝與檢定①菌種：采用鼠疫桿菌弱毒菌株EV株②培養及收獲：培養基：厚金格爾瓊脂培養基（pH6.8~7.2）肉眼檢查及純菌試驗合格方可收獲。③半成品配制及凍干細菌比濁標準調整原液濃度，加凍干保護劑，分裝。④成品檢定：鑒別試驗、理化實驗、純菌試驗、特異性毒性試驗、活菌數測定、濃度測定、菌形檢查、效力測定⑤疫苗規格及效期10人份含菌8×109，2~8℃避光保存運輸，有效期一年。45第四節類毒素疫苗一、概述類毒素是一種主動免疫制劑，用于細菌毒素性疾病的預防。461.有關毒素的幾個概念①細菌毒素：致病細菌產生的特異性毒性物質②外毒素：細菌在生長過程中產生，可擴散或自溶后釋放到菌體外③內毒素：菌體細胞壁的結構成分，生存時不釋放，死亡后釋放至外界④類毒素：外毒素經處理后去除毒性但仍保留免疫原性472.細菌外毒素的特性1）毒性強2）親組織性3）抗原性4）雙組分結構蛋白質483.類毒素的生產1）產毒人工培養產毒細菌獲得毒素①菌種產毒力強、穩定②產毒培養基49培養基應符合下面幾個方面的要求（1）能提供產毒必要的成分（2）能調節影響產毒諸因素的平衡（3）能緩解對產毒有害物質的作用（4）能保護已經產生的毒素（5）不能含有對人有害或引起過敏反應的物質50③培養方法根據菌種的特性與具體的實驗來決定2）脫毒影響因素：溫度、pH、甲醛濃度、毒素3）精制適用于規模化生產，條件溫和，避免對抗原的損傷514.毒性逆轉及其相關因素毒素類毒化后仍有毒性逆轉的可能，與毒性逆轉有關的因素有：①稀釋②脫毒條件③小分子物質的影響52二、常用細菌類毒素疫苗1.白喉類毒素1）概述由白喉桿菌引起的急性呼吸道傳染病，產生外毒素引起局部炎癥及組織壞死532）白喉桿菌的病原學（1）形態及生活習性：革蘭氏陽性棒狀桿菌，需氧或兼性厭氧，抵抗力較弱（2）分型：重型、中間型、輕型，流行中的多為輕型，引起的癥狀最輕（3）白喉毒素（Diphtheriatoxin）的分子結構及致病機制543）白喉類毒素的生產工藝與檢定（1）生產工藝①菌株：PW8或由其篩選得到②產毒培養基：氮源、能源、生長因子、無機離子③培養：嚴格控制雜菌污染④精制：硫酸銨、活性炭分段鹽析法或其他適宜方法⑤脫毒：甲醛脫毒后進行脫毒檢查⑥吸附精制白喉類毒素：以Al（OH）3吸附劑為免疫佐劑55（2）白喉類毒素的檢定①鑒別試驗②外觀③化學檢定④安全試驗⑤保護力試驗562.破傷風類毒素1）概