ICS65.020.3023CCSB4423黑 龍 江 省 地 方 標 準DB23/T3873—2024實動物 實豬副感病毒5型RT-PCR檢技術范2024-08-30發布 2024-09-29實施黑龍江省市場監督管理局??發布DB23/T3873DB23/T3873—2024II前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由黑龍江省科學技術廳提出并歸口。本文件起草單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。本文件主要起草人：陳建飛、馮力、劉懷然、張鑫、郭龍軍、石達、時洪艷。DB23/T3873DB23/T3873—2024PAGEPAGE10實驗動物 實驗豬副流感病毒5型RT-PCR檢測技術規范范圍本文件規定了實驗豬副流感病毒5型RT-PCR檢測的樣品采集、樣品記錄保存、樣品處理、病毒RNA提取、RT-PCR操作程序和結果判定的要求，描述了相應的操作方法。本文件適用于實驗豬糞便、小腸及內容物中副流感病毒5型的定性檢測。規范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682 分析實驗室用水規格和實驗方法GB19489 實驗室生物安全通用要求NY/T1948獸醫實驗室生物安全要求通則SN/T4835—2017實驗室生物廢棄物管理要求術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。縮略語下列縮略語適用于本文件。cDNA：互補脫氧核糖核酸（complementaryceoxyribonucleicacid）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）dd（douledisilldwae）dNTPs：三磷酸脫氧核糖核苷混合物（deoxyribonucleotidetriphosphatemixture）M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（moloneyMurineLeukemiaVirus）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）PPIV5：豬副流感病毒5型（porcineparainfluenzavirus5）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）RT-PCR：反轉錄-聚合酶鏈式反應（reversetranscription-polymerasechainreaction）基本要求生物安全應按照GB19489、NY/T1948、SN/T4835－2017的規定執行。人員采樣人員應具有一定的專業技術知識，熟練掌握采樣工作程序和采樣操作技術。采樣時應戴口罩、手套，穿一次性防護服、鞋套。RNART-PCR樣品采集采樣工具手術刀、剪刀和鑷子應無菌處理。一次性無菌注射器、無菌采樣棉簽和無菌采樣管（2mL、25mL、50mL）。糞便采集用一次性無菌注射器吸取腹瀉豬只的糞便1mL～2mL，或輕輕擠壓腹瀉豬的腹部，用無菌采樣棉簽從肛門處采集糞便5g～10g，放入無菌采樣管中編號保存備用。小腸及內容物采集（的腸管兩端結扎，用剪刀在結扎線外端剪斷，放入無菌采樣管中編號保存備用。樣品保存記錄保存樣品應及時采用低溫運輸到實驗室。樣品在2℃～8℃條件下保存不應超過24h；在-20℃～-15℃條件下保存不應超過1個月。記錄收到樣品后，應做好記錄。樣品處理糞便在生物安全柜內向保存樣品的無菌采樣管中加入等體積含雙抗的0.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（A.1），經振蕩器2000r/min震蕩3min～5min，經離心機45000r/min離心20min，取上清液，立即進行病毒RNA提取。注：如不能立即試驗，可冷凍保存上清液，并在2日內提取病毒RNA。小腸及內容物在生物安全柜內取3cm～5cm的小腸及其內容物，稱重，用含雙抗的0.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（A.1）按重量體積比制成545000r/min離心20min，取上清液，立即進行病毒RNA提取。注：如不能立即試驗，可冷凍保存上清液，并在2日內提取病毒RNA。RNA在生物安全柜內提取病毒RNA，提取方法按照附錄B執行。注：如不能立即進行cDNA合成，可將病毒RNA置-70℃保存，并在2日內使用。RT-PCRcDNA在生物安全柜內合成cDNA，合成方法按照附錄C執行。注：如不能立即進行PCR反應，可將cDNA置-20℃保存，并在2日內使用。PCR在潔凈臺內配制PCR反應體系，配制方法按照附錄D執行。PCR儀器設備10.3.1.1分析天平：分度值不大于0.1mg。10.3.1.2容量瓶：容積分別為100mL、500mL、1000mL、5000mL。10.3.1.3微波爐：容量不小于18L，功率為500W～900W。10.3.1.45V～600V4mA～400mA1W～240W。10.3.1.5水平電泳槽：容積不小于300mL。10.3.1.6凝膠成像系統：分辨率不小于130萬像素。10.3.1.7微量移液器：10μL。10.3.1.8量筒：容量200mL。10.3.1.9無菌配套吸頭：10μL。試劑50×TAEA.21×TAEA.36A.41A.5DNAMarker100bp～2000bp。試驗步驟取3μL～5μL擴增產物與0.6μL～1μL6×電泳加樣緩沖液混勻，加到凝膠孔內，再加入標準分子量。在150V～180V條件下電泳10min～15min。用凝膠成像儀觀察凝膠，并拍照、記錄檢測結果。凝膠和剩余PCR產物應做無害化處理。結果判定試驗成立條件陽性對照應出現336bp左右的特異性目的條帶，并且陰性對照應無特異性目的條帶。判定符合11.1，若待檢樣品泳道有336bpPPIV5PPIV5核酸陰性。PCR產物電泳圖見附錄E。若進一步驗證，宜對擴增產物進行測序。附 錄 A（規范性）溶液配制0.02mol/LpH7.2（PBS）0.2mol/（N2HPO?12O71.64gddH溶解，定容至1000mL，混勻。0.2mol/L的磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaHPO4·2HO）31.21g，加適量ddH2O溶解，定容至1000mL，混勻。0.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液：分別量取0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液360mL、0.2mol/L磷酸140m38，用ddHO5000mL4℃保存。0.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液滅菌后，加入無菌青霉素和鏈霉素，終濃度分別為1000IU/mL和1000μg/mL。50×TAE稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）242g、乙二胺四乙酸二鈉（NaEDA）37.2g溶于800mLdO中，加入57.1mddO定容至1000mL1×TAE用ddO將50TAE506×電泳加樣緩沖液稱取乙二胺四乙酸（EDTA）4.4g、溴酚蘭0.25g、二甲苯藍FF0.25g溶于200mLddH2O中，加熱攪拌充分溶解。冷卻至室溫，加入180mL甘油，以2mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0，用ddH2O定容至500mL。室溫保存。1瓊脂糖凝膠稱取1g瓊脂糖，加入100mL1×TAE電泳緩沖液，微波爐加熱融化，搖勻。待溫度降至40℃左右時，加入10mg/mL溴化乙錠（EB）或EB替代物5μL，均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。附 錄 B（規范性）RNA儀器設備臺式低溫離心機：溫度范圍為2～8℃，轉速不小于12000r/min。高壓滅菌鍋：壓力不小于0.1MPa，溫度范圍為105～135渦旋振蕩器：不小于100r/min。B.1.4 冰箱：-70～-65℃。生物安全柜：空氣流速范圍為100～400ft/min，噪音水平不超過65dB，振動水平不超過0.0254mm，過濾器效率在99.99%以上。微量移液器：2.5μL、10μL、200μL、1000μL。無RNA酶的無菌配套吸頭：10μL、200μL、1000μL。無RNA酶的滅菌離心管：1.5mL。試劑異丙醇，分析純。無水乙醇，分析純。Trizol試劑。酚氯仿抽提液：苯酚、三氯甲烷、異戊醇體積比為25:24:1。DEP水：ddO0.175DEPC水按3:1配制而成。陽性對照：已知病毒材料，如PPIV5感染的細胞。方法在生物安全柜內，取待檢樣品上清液和陽性對照各300μL分別置于1.5mL無RNA酶的滅菌離心管中，加500μLTrizol10min。加入500μL酚氯仿抽提液，充分混勻，室溫靜置10min。在412000r/min離心10min，取上清液500μL于新的無RNA酶的滅菌離心管中，加入1.0mL異丙醇，充分混勻，在-2030min。在412000r/min離心101.0mL75412000r/min離心10min，小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，室溫自然風干。向離心管中加入20μLDEPC水溶解RNARNA溶液，立即使用。注：若條件允許，還可采用商品化核酸提取試劑盒、自動化核酸提取儀及配套核酸抽提試劑提取病毒RNA。附 錄 C（規范性cDNA儀器設備臺式低溫離心機：溫度范圍為2～8℃，轉速不小于10000r/min。制冰機：功率為0.5kW～20kW。C.1.3 冰箱：-20～-15℃。電熱恒溫水槽：溫度范圍為5℃～95℃。生物安全柜：空氣流速范圍為100～400ft/min，噪音水平不超過65dB，振動水平不超過0.0254mm，過濾器效率在99.99%以上。微量移液器：2.5μL、10μL、200μL、1000μL。無菌配套吸頭：10μL、200μL、1000μL。無RNA酶的滅菌離心管：1.5mL。試劑5×M-MLV緩沖液。dNTPs，各10mmol/L。RNase抑制劑，40U/μL。M-MLV逆轉錄酶，200U/μL）。隨機六聚體，Random6mers，10μmol/L。樣品病毒RNA。陽性對照RNA。方法在生物安全柜內取制備的病毒RNA12.5μL分別置于無RNA酶的滅菌離心管中，加入1μL隨機6聚體、混勻，7010min、冰浴2min。4μL5×M-MLV1μLdNTPs0.5μLRNase1.0μLM-MLV逆轉錄酶，混勻。421h。7015min、冰浴3min，得到cDNA溶液，立即使用或置-20℃保存、備用。附 錄 D（規范性）PCR引物1ddO配制成10mmo/表D.1PCR引物和擴增產物大小引物名稱引物序列產物大小NP9F5′-CGTGCTTAAAGCATATGAGCGA-3′336bpNP326R5′-ATTAAGCGGAATGATCCCT-3′儀器設備D.2.1 PCR孔或3×32孔或3×210～1004/秒～6/秒。微量移液器：10μL、200μL。無菌配套吸頭：10μL，200μL。PCR擴增管：0.2mL。試劑10×Exbuffer。2.5mmol/LdNTPs。ExDNA聚合酶。滅菌dd0。NP9F，10mmol/L。NP326R，10mmol/L。樣品cDNA。陽性對照cDNA。反應體系在PCddO17.5L10Exqbufer2.5