AFLP分子標記技術及其應用涪陵師范學院生命科學系主講人：江

波AFLP

分子標記技術及其應用?一、什么叫AFLP？?二、AFLP?三、AFLP?四、AFLP的基本原理是什么？的實驗過程怎樣？的應用研究如何？?五、對AFLP的評價我們都知道世界是多姿多彩的，可以說是五彩斑斕，花樣百出，無奇不有！從生物學這個角度來看，這到底是什么原因呢？主?要生是物是的因多為樣生性物主具要有包括多四樣個性層！次！即！：？遺？傳多樣性、物種多樣性、生態系統多樣性和景觀多樣性。?而遺傳多樣性是其它多樣性的基礎，也可以說，生物多樣性歸根到底就是遺傳多樣性。?那么大家知不知道遺傳多樣性是如何檢測的呢？a.多態性高；共顯性遺傳,在二倍體的生物中能區分純合與雜合狀態；在基因組中頻繁出現,甚至貫穿分布于整個基因組；選擇中性；e.容易獲得；f.容易操作,自動化程度高；h.所得數據可在實驗室之間交流和比較?（1）形態學標記?（2）細胞學標記?（3）生化標記?（4）分子標記

我們這里講的AFLP就是一種分子標記技術。它是AmplifiedFragment

LengthPolymorphism的簡寫,g.重復性好；叫做擴增片斷長度多態性。分子標記的歷史:?第一代分子標記技術RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制性片段長度多態性）?第二代分子標記技術RAPD（Random

AmplifiedPolymorphicDNA,隨機擴增多態性DNA ）?

AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphis,m擴增片斷長度多態性）?事實上,還有很多分子標記技術像SSR、ISSR、SRAP（相關序列擴增多態性）另外,還有現在號稱為第三代分子標記的SNP（單核苷酸多態性)等AFLP

的基本原理?基因組DNA經兩種限制性內切酶酶切,形成分子量大小不等的隨機限制性酶切片段,將特定的人工合成的短的雙鏈接頭連在這些片段的兩端,形成一個帶接頭的特異片段,通過接頭序列和PCR引物3ˊ端選擇性堿基的識別,對特異性片段進行預擴增和選擇性擴增。最后只有那些兩端序列能與選擇性堿基配對的限制性酶切片段才能被擴增；最后將選擇性擴增產物在高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳,尋找多態性擴增片段。AFLP

的實驗流程?模板制備?DNA的提取（SDS法和CTAB法）?酶切?連接?PCR擴增(PCR

AMPLIFIED)擴增片段通常用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,根據擴增片段大小范圍選擇應用4%一10%的凝膠電泳。?預擴增(Pre-amplified)?選擇性擴增(Elective

amplified)應用放射自顯影、銀染、熒光測序儀等方法顯示結果,通過Gene-Scan,Gel-Compare等軟件進行數據分析。?擴增產物凝膠電泳?結果分析DNA的提取（

SDS法和CTAB法）?SDS是Sodiumdodecylsulfa的te縮寫稱為十二烷基磺酸鈉,?CTAB是Cetyltrimethylammoniumbromide的縮寫十六烷基三甲基溴化氨,?兩種都是去污劑,它們都能破壞細胞膜使膜蛋白變性沉淀,故而使核酸釋放出來,另外,它還能保護DNA不受內源核酸酶的降解。酶切? 為了使酶切片段大小分布均勻，一般采用兩個限制性內切酶，一個用6個堿基識別位點的限制性內切酶(常用EcoRI,、PstI或SacI)，另一個用4個堿基識別位點的限制性內切酶(常用MseI、TaqI)。采用雙酶切的主要原因有:(1)多切點酶產生較小的DNA片段，而切數點較少的酶能夠減少擴增片段的數目，因為擴增片段主要是多切點酶和切點數較少的酶組合產生的酶切片段，這樣就可以減少選擇擴增時所需要的選擇堿基數。(2)雙酶切可以進行單鏈標記，從而防止形成雙鏈造成的干擾。 (3)雙酶切可以對擴增片段數進行靈活調節。(4)通過少數引物可產生許多不同的引物組合，從而產生大量的不同的 AFLP指紋。這樣，經過酶切后就形成了三種類型的酶切片段，如EcoRI/MseI酶切形成EcoRI一EcoRI片段、EcoRI一MseI片段、Mse工一MseI片段，由于AFLP技術革新成功的關鍵在于DNA的充分酶切，所以對模板質量要求很高，要注意避免其它DNA污染和抑制物質存在。連接?酶切后的DNA片段在T4

DNA

連接酶作用下與兩種內切酶相應的特定接頭相連接,形成帶接頭的特異性片段。接頭為雙鏈,由兩部分組成,一部分是核心序列,一部分是酶特定序列(能與酶切片段粘端互補),通常在酶特定序列中變換了一個內切酶識別位點的堿基,保證了連接片段不能再被酶切。只有遵循“引物擴增原則”設計的接頭才能得到滿意的擴增結果。PCR擴增(PCR

AMPLIFIED)? 應用與接頭相識別的引物進行擴增。AFLP引物由三部分組成:（1）5′端的與人工接頭序列互補的核心序列(coresequence（)2）限制性內切酶特定識別序列(enzyme-specificsequence（)3）3′端的帶有選擇性堿基的粘性末端(selectiveextensio，n)其中AFLP接頭的設計(包括核心序列和酶特定序列)是關鍵之處，常用的多為EcoRI和MseI接頭，接頭和與接頭相鄰的酶切片段的堿基序列是引物的結合位點，合成的寡核苷酸接頭經過94℃變性，37℃退火，4℃保存備用；理論上每增加一個選擇性堿基，將只擴增限制性片段的1/4，而在兩個引物上都有三個選擇性堿基的情況下，則僅獲得 1/4096的片段；也就是說，只有那些兩端序列能與選擇堿基配對的限制酶切片段被擴增。所以選擇性堿基是選擇用于擴增的特定的限制性片段的一種精確而有效的方法；?預擴增(Pre-amplified)?擴增所用引物3′端有一個選擇堿基,通過預擴增對擴增模板進行初步篩選,一方面可以避免直接擴增造成的指紋帶型背景拖尾現象,另一方面可以避免直接擴增由引物3′端3個選擇堿基誤配形成的擴增產物。?選擇性擴增(Electiveamplified)?預擴增產物經稀釋后進行選擇性擴增,使所需模板量不受限制。所用引物3′端有3個選擇堿基的延伸,通過3個選擇堿基的變換獲得豐富的DNA片段。AFLP

技術的改良? 內切酶的應用?有多種內切酶組合如EcoRI、PstI、SacI、HindIII或Apal與MseI、TaqI用于AFLP 技術?只應用一種內切酶制備模板（單酶切）?也有應用三種內切酶的報道（三酶切）TE-AFLP? 引物的標記及結果顯示?引物標記已從同位素標記發展到目前的熒光標記,熒光標記減少了同位素對人體的損害,同時使結果分析更加便利準確,但費用仍然很高,單酶切AFLP 法的引物不需要標記,只需通過瓊脂糖凝膠電泳、紫外透射儀觀察結果,省時、方便,但溴化乙錠對人體有危害。現有一種銀染法可以降低成本又對人體無害,但操作相對復雜繁瑣又費時。? 其它類型?AFLP 技術是基于對基因組DNA的分析而創建的,目前已有cDNA-AFLP ,還有甲基化敏感-AFLP。EcoR

IMse

I（限制性內切酶）EcoR

I接頭Mse

I接頭EcoR

I引物+AMse

I引物+C（預擴增）EcoR

I引物+AACMse

I引物+CAA（選擇擴增）（連接）（電泳檢測）AFLP

的應用研究?AFLP技術在植物研究上的應用?基因定位及構建遺傳圖譜?遺傳多樣性分析和種質資源鑒定?輔助育種?研究基因表達與調控?居群的遺傳結構與保護生物學研究?其它方面的應用?AFLP結合BSA(分群分析法,Bulksegregateanalysi)s可進行基因的快速定位；Ballvora利用AFLP技術結合BSA法精確定位了馬鈴薯的根包囊線蟲抗病基因Grol；AFLP技術能找出因基因槍法或完整細胞電穿孔而產生的轉基因大米中發生的隱藏的基因改變；對于構建遺傳圖譜,AFLP被認為是迄今最有效的分子標記技術；近幾年來,利用AFLP技術已對桉樹、楊樹、松樹、桃樹進行了遺傳圖譜的構建并取得了長足的進展。AFLP技術在植物基因定位及構建遺傳圖譜上的應用AFLP技術在植物遺傳多樣性分析和種質資源鑒定上的應用?

種質資源收集的遺傳多樣性可通過譜系記錄與DNA

指紋分析兩條途徑相結合,其目的是對種質資源進行分類、描述雜合的類群與雜合式樣、追索育種的歷史； AFLP在鑒定與評估種質資源方面有廣泛的應用前景；有人進行了花生多態標記的AFLP鑒定；有人用AFLP評估了太平洋西北小麥品種的遺傳多樣性；還有人用了 6個AFLP引物組合得到359個AFLP擴增帶,對24個向日葵優良品系的遺傳多樣性進行了分析。另周志勇等人采用雙酶切的方法,將AFLP技術應用于人參、西洋參基因組指紋圖譜,發現二者在遺傳上有較近的親緣關系,但引種到我國吉林的西洋參與西洋參基因組DNA相比有一定變異,證明了AFLP分子標記技術有望成為一種獨立的、確實可行的手段,用于人參、西洋參等藥用植物品種的鑒別。AFLP技術在植物輔助育種研究上的應用? 在指紋圖譜技術出現以前,基因圖譜只能依靠植物的表現型和同工酶分析來建立DNA 指紋圖譜,特別是AFLP技術的出現,使標志的數量大大增加,進而使分辨率大大提高；特定農業性狀與標志連鎖關系的建立在育種上有重大的經濟價值,使得定向育種成為可能,不僅減少了育種的工作量,而且還使時間縮短,使人們能在植物生長早期就預知它的某些性狀并加以篩選； Jonathan等人通過AFLP標志研究番茄,發現許多DNA 標志與番茄抗葉霉病菌的基因相聯系；同樣,ChristianeGebhardts小組發現29條AFLP標志與馬鈴薯抗晚疫病菌的R1基因有關,2條與抗孢囊線蟲的基因有關；用相同的方法Matthews等也發現與白楊抗葉銹病相關的標志；這種將傳統育種與現代分子生物學結合的分子標記協助育種已被大量的采用。AFLP技術在植物基因表達與調控研究上的應用?Bachem等人采用AFLP技術檢測了馬鈴薯塊莖發育過程中基因表達情況,他們利用3個引物組合,進行塊莖發育不同時期的AFLP分析,得到了塊莖特異轉錄的片段TDFS,2個TDFS片段與關鍵基因LOX高度同源,且二者在塊莖的不同時期表達的量不一樣；表明了AFLP是研究基因表達非常有效的方法,可同時比較植物不同時期以及分離某些重要基因。AFLP技術在植物居群的遺傳結構與保護生物學研究研究上的應用Travis等1996年第一次將AFLP產生的220個多態標記用于評估一種臨界于瀕危的黃芪屬(Astragalu)s植物（Astragaluscremnophylaxvar.cremnophylax）的3個已知居群的居群內與居群間的多態信息含量和遺傳變異的分配,他們還用AMOVA 分析了居群間的分化；這些結果指出在居群內存在空間上分離的組,與UPGMA 聚類和主成分分析的結果一致；提出了保護這個物種的若干建議；Krauss和Peakell用AFLP對Persooniamolli的天然居群作了分析；Winfield1988年研究了英國Sevem地區黑楊亞種Populasnigrasubsp.Betulifol的ia遺傳多樣性；Breyne等1997年將Arabidopsisthalian作a為模式物種,用AFLP技術評估了基因組的多樣性；他們認為AFLP 測十分相近的基因型之間的細微差異足夠靈敏,非常適合于評估居群內與居群間的多樣性水平和描述種下水平的遺傳關系；他們也用AFLP測定天然居群和熱帶樹種的遺傳變異。其它方面的應用?AFLP 技術除可以用于植物方面外還可以用于動、微生物、寄生蟲、昆蟲、人群等方面。吳豐春等應用AFLP技術采用單酶切對小鼠進行了遺傳檢測的研究,為小鼠從DNA上的遺傳檢測提供了一種新的技術手段；AFLP技術在微生物學領域的應用也相當廣泛,在微生物分類、基因標定、親緣關系及遺傳多樣性研究都有不俗的表現,特別是微生物的鑒定和品系分析方面更是成績可佳。在流行病檢測中AFLP 標記已成為微生物病原體診斷的理想技術。在腫瘤發病機制的研究中,腫瘤易感基因的檢測是首要任務,而AFLP標記為腫瘤基因組的檢測帶來了一種新的方法。是一種較為理想的技術。FukudaT等用cDNA-AFLP 法對大鼠高低轉移性骨肉瘤基因組進行對比檢測,得到43條差異片段,通過篩選,克隆出與大鼠骨肉瘤轉移有關的4種差異表達基因；MajimaS等應用同樣的方法克隆出與腎癌發生相關的一種新基因—Niban；YamamotoF應用甲基化敏感-AFLP技術檢測了乳腺癌的基因變化。這些都會對以后研究腫瘤發病機制發揮重要作用。五、對AFLP的評價?AFLP技術特點?（1）所需DNA 量少,擴增效率高,多態性強,易于分辨。?（2）AFLP"標記結果穩定可靠,重復性強,不受基因組來源和復雜度的影響,使不同時間、不同實驗室的結果可以進行比較,有利于進行回顧性研究,并促進信息與資料的交流,達到資源共享。?（3）AFLP標記呈典型的孟德爾遺傳,可作為物理圖譜和遺傳圖譜的聯系橋梁,用于構建基因組高密度連鎖圖譜。?（4）圖譜構建聚類顯著,定位專一。?（5）AFLP對模板濃度不敏感,允許一定強度的共擴增,樣本DNA量相差1000倍仍可獲得相同的結果。作為DNA指紋技術的評價? 眾多研究者對RFLP及SSR,RAPD,AFLP 四種分子標記技術進行了比較分析,綜合考慮遺傳穩定性和標記系統機制(速度、費用、可靠性),提出了標記指數MI(Markerindex),MI是變異指數DI(Diversityindex和)有效復合比EMR(Eff