甘藍類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術規程（送審稿）編制說明《甘藍類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術規程》編制組2024年8月一、目的意義1.產業發展現狀甘藍類蔬菜作物種類眾多，包括結球甘藍、花椰菜、青花菜、芥藍、苤藍、羽衣甘藍、抱子甘藍等十余種變種類型，在我國不同地域均有分布和種植。在諸多甘藍類蔬菜中，結球甘藍的種植面積約為1400萬畝，花椰菜和青花菜種植面積分別約為700萬畝和130萬畝，在全國蔬菜周年供應及出口貿易中占有十分重要的地位。江蘇省是甘藍類蔬菜的重要產區，播種面積約為200萬畝。隨著甘藍類蔬菜栽培面積的逐步擴大及復種指數的提高，由蕓薹生鏈格孢（Alternariabrassicicola）引起的黑斑病呈加重態勢。此外，黑斑病菌還能侵染角果，導致種子帶菌，從而影響制種產量和質量。2.制定標準的必要性目前生產上缺乏商業化的抗病品種，化學藥劑成為防治黑斑病的主要手段。黑斑病菌的準確識別對于化學藥劑選擇和施藥時機把握具有重要生產意義。重組酶聚合酶擴增（recombinasepolymeraseamplification，RPA）是一種新型恒溫擴增技術，該技術可在較低恒溫（37℃~42℃）條件下，通過重組酶、單鏈DNA結合蛋白、鏈置換DNA聚合酶的作用，在短時間內實現目標區段的高效擴增。本項目制定的甘藍類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術規程，旨在通過標準化檢測，及時掌握黑斑病的發生危害程度，提高黑斑病的防控意識和能力，對促進江蘇省甘藍類蔬菜產業高質量發展具有十分重要的意義。3.制定標準的可行性江蘇省農業科學院與江蘇省農業技術推廣總站在甘藍類蔬菜病害綠色防控技術研發和推廣方面具有良好的合作基礎，在國家重點研發計劃子課題、江蘇省重點研發計劃、江蘇省農業科技自主創新資金等相關項目的資助下，在黑斑病病原的鑒定與分子檢測、抗病種質資源篩選與利用等方面開展了大量工作。本規程是在試驗研究的基礎上，結合文獻查閱而提出，該技術規程可實現目標病原菌的特異靈敏檢測，助力黑斑病的長效防控。二、任務來源2023年8月4日，江蘇省市場監督管理局發布《關于下達2023年度江蘇省地方標準項目計劃的通知》（蘇市監標〔2023〕173號），下達2023年度343項地方標準制（修）訂項目，其中122號《甘藍類蔬菜真菌性黑斑病快速檢測技術規程》標準編制的任務，由江蘇省農業科學院、江蘇省農業技術推廣總站共同負責起草制定。經專家建議和進一步的資料檢索，我們發現引起甘藍類蔬菜黑斑病的病原雖有細菌和真菌之分，但通常只將細菌引起的黑斑病稱為細菌性黑斑病，而鏈格孢屬真菌引起的病害則仍稱為黑斑病。因此在不改變范圍和標準技術內容的基礎上，我們對標準名稱進行了適當修改，更改后的標準名稱為“甘藍類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術規程”。三、編制過程（1）成立編制組2023年8月，收到江蘇省市場監督管理局《關于下達2023年度江蘇省地方標準項目計劃的通知》文件后，立即成立標準起草小組，由余方偉擔任組長，曾曉萍、李建斌、馬金俊、王神云、張偉、于利6位成員組成。（2）起草階段2023年8月，起草組系統查閱了十字花科蔬菜黑斑病的病原鑒定、發生規律、綜合防控和黑斑病菌分子檢測等有關的技術資料，對收集的資料進行全面分析、比較，結合起草組承擔的各類國家和省級項目在黑斑病病原分離、分子檢測等方面的研究成果，確定了標準的指標設置，并于2024年4月完成初稿，隨后召開內部討論會，根據討論會意見對文稿進行進一步修改完善，2024年5月形成了征求意見稿。（3）征求意見情況2024年5-8月，將征求意見稿發送至浙江大學、中國農業科學院、北京市農林科學院、南京農業大學、西南大學、福建農林大學、青島農業大學、安徽農業大學、云南農業大學、山東省農業科學院、重慶三峽農業科學院、宜興市蔬菜辦公室和江蘇中江種業股份有限公司等13家單位相關專家征求意見，共征集到來自11個單位11位專家的32條意見，起草小組根據專家意見進行修改完善，最終形成了送審稿。四、標準編制原則和依據（一）標準的編寫原則本標準遵循“科學、適度、可行”的原則，嚴格按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定進行編寫。在標準的征求意見稿和送審稿的編制過程中力求做到技術內容的敘述正確無誤，文字表達準確、簡單易懂，標準的構成嚴謹合理，內容編排符合邏輯。制定的標準力求切實可行，易于為相關從業者所掌握和使用。（二）標準的提出依據蕓薹生鏈格孢是引起甘藍類屬蔬菜黑斑病的主要病原。目前，國內尚未正式制定“甘藍類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術規程”的國家或行業技術規程。標準起草小組為解決甘藍類蔬菜黑斑病菌的RPA檢測，前期開展了該檢測技術的靶標選擇、引物設計、反應體系優化、室內檢測的研究。最終，標準起草小組在結合國內外文獻檢索和現有試驗結果的基礎上，撰寫了基于RPA的甘藍類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術規程。主要參考文獻如下：[1]劉煥然,柯桂蘭.十字花科蔬菜黑斑病原種群組成及季節變化[J].西北農業學報,1992,1(4):6-10.[2]肖長坤,李勇,李健強.十字花科蔬菜種傳黑斑病研究進展[J].中國農業大學學報,2003,8(5):61-68.[3]李明遠.十字花科蔬菜黑斑病識別與防治[J].當代蔬菜,2004,(10):34-36.[4]文朝慧,李鐵夫,王軍平,劉箐,周圍.出口蘿卜種子中蕓薹生鏈格孢的分離與鑒定[J].植物檢疫,2007,21(1):4-6.[5]王漢榮,方麗,任海英,蘇英京.青花菜黑斑病的識別與防治[J].中國蔬菜,2010,(5):23-24.[6]王超,張曉烜,王寧寧.甘藍黑斑病病原菌鑒定[C]//中國園藝學會十字花科蔬菜分會.中國園藝學會十字花科蔬菜分會第十屆學術研討會論文集.2012:5.[7]王瑩瑩,宋加偉,石延霞,張揚,李寶聚.李寶聚博士診病手記（八十四）白菜黑斑病病原菌鑒定及防治方法[J].中國蔬菜,2015,(7):72-74.[8]ChoY.HowthenecrotrophicfungusAlternariabrassicicolakillsplantcellsremainsanenigma[J].EukaryoticCell,2015,14(4):335-344.[9]高威芳,朱鵬,黃海龍.重組酶聚合酶擴增技術:一種新的核酸擴增策略[J].中國生物化學與分子生物學報,2016,32(6):627-634.[10]付永文.西蘭花黑斑病重發原因與防控技術初探[J].中國農技推廣,2016,32(12):47-49.[11]DonosoA,ValenzuelaS.In‐fieldmoleculardiagnosisofplantpathogens:recenttrendsandfutureperspectives[J].PlantPathology,2018,67(7):1451-1461.[12]NowakowskaM,WrzesińskaM,KamińskiP,SzczechuraW,LichockaM,TartanusM,KozikEU,NowickiM.Alternariabrassicicola–Brassicaceaepathosystem:insightsintotheinfectionprocessandresistancemechanismsunderoptimizedartificialbio-assay[J].EuropeanJournalofPlantPathology,2019,153:131-151.[13]馮黎霞,魏霜,余辛,張永江,武目濤,胡學難.重組酶聚合酶擴增技術（RPA）快速檢測玉米褪綠斑駁病毒[J].植物保護學報,2020,47(1):217-218.[14]周瑩,岳瑾,李云龍,劉梅,喬廣行.重組酶介導的等溫擴增技術及其在植物病原檢測中的應用[J].中國植保導刊,2020,40(6):27-31.[15]馬志敏,段玉,許建建,賓羽,周常勇,宋震.基于重組酶聚合酶擴增技術（RPA）的柑橘潰瘍病菌檢測方法[J].園藝學報,2021,48(3):590-599.[16]馬文娣,田逸英,焦志遠,周濤,范在豐.重組酶聚合酶擴增技術在植物病原快速檢測中的應用[J].植物保護,2021,47(3):1-5+13.[17]沈鈺森,王建升,盛小光,趙振卿,虞慧芳,顧宏輝.十字花科植物黑斑病的研究進展[J].核農學報,2021,35(3):623-634.[18]陳永生,崔志超,楊雅婷,管春松,高慶生,劉先才.關于甘藍類蔬菜種植模式規范化的建議[J].長江蔬菜,2021,(8):20-21.[19]辛竹琳,崔彥娟,楊小薇,孔令博,林巧.全球蔬菜產業現狀及中國蔬菜育種發展路徑研究進展[J].分子植物育種,2022,20(9):3122-3132.[20]ChenS,YuanH,YanX.RapidvisualdetectionofbenzimidazoleresistanceinBotrytiscinereabyrecombinasepolymeraseamplificationcombinedwithalateralflowdipstick[J].PestManagementScience,2022,78(2):821-830.[21]ClarkKJ,AnchietaAG,daSilvaMB,KandelSL,ChoiYJ,MartinFN,CorrellJC,VanDenyzeA,BrummerEC,KlostermanSJ.Earlydetectionofthespinachdownymildewpathogeninleavesbyrecombinasepolymeraseamplification[J].PlantDisease,2022,106(7):1793-1802.[22]劉志剛,余方偉,張偉,于利,李建斌,王神云,宋江華.甘藍黑斑病病原菌鑒定及其對殺菌劑的敏感性[J].江蘇農業學報,2023,39(4):947-955.[23]XuJ,YangX,WuC,ChenZ,DaiT.Recombinasepolymeraseamplification-lateralflowdipstickassayforrapiddetectionofFusariumcircinatumbasedonanewlyidentifieduniquetargetgen