ICS65.020.10CCSB0532IdentificationofSorghumMoenchusingInDelmarkeIDB32/TXXXX—2024 II 12規范性引用文件 3術語和定義 4縮略語 1 26主要儀器設備及試劑 27溶液配制 28引物相關信息 29參照品種 210操作程序 211結果統計 512結果判定 5 7 9 DB32/TXXXX—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由江蘇省農業科學院提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省農業科學院、中國農業科學院生物技術研究所、貴州省旱糧研究所。本文件主要起草人：鐘小仙、薛文韜、朱莉、高杰、劉智微、陳曉強。1DB32/TXXXX—2024高粱屬品種鑒定InDel分子標記法本文件規定了利用核苷酸插入和缺失序列（InDel：Insert-delete）分子標記進行高粱屬(SorghumMoench)品種DNA指紋鑒定的試驗方法、數據采集、結果記錄及判斷標準。本文件適用于高粱屬酒用、糧用和飼用高粱、甜高粱、蘇丹草、高丹草、擬高粱中的DNA分子數據采集和品種鑒定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農作物種子檢驗規程扦樣GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法NY/T2594植物品種鑒定DNA分子標記法總則3術語和定義NY/T2594界定的術語和定義適用于本文件。4縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：basepair，堿基對。CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨。DNA：deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸。dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphate，脫氧核糖核苷三磷酸。EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶鏈式反應。InDel：insertanddelete，插入和缺失序列。SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基硫酸鈉。Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐熱DNA聚合酶。TAE：Tris-acetate-EDTA，三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸。Tris：Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM，三羥甲基氨基甲烷。TE：Tris-EDTA，三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸。TD-PCR：Touch-downPCR，降落PCR。2DB32/TXXXX—20245原理不同高粱屬品種由于遺傳組成不同，在基因組DNA中某InDel位點存在大片段序列差異，這種差異可通過瓊脂糖凝膠電泳或熒光毛細管電泳檢測，從而對不同品種進行區分鑒定。6主要儀器設備及試劑主要儀器設備及試劑見附錄A。7溶液配制溶液配制方法見附錄B。8引物相關信息引物序列及相關信息見附錄C。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測時選擇普通引物；利用熒光毛細管電泳檢測時選擇熒光標記引物，熒光標記位于正向引物5'端，熒光標記推薦使用6-FAM，允許配合HEX、TAMRA、ROX其他三色熒光標記多重電泳。采集指紋、構建數據庫時，一般使用全部引物；品種鑒定時，允許利用附錄C中的引物序貫檢測，當檢測到的差異位點數能判定送檢樣品與參照樣品不同時，即可停止檢測。9參照品種參照品種用于輔助確定送檢樣品在某個位點的等位變異，宜與送檢樣品同時檢測。參照品種包括BTx623、Rio、Tx430、紅纓子、江蘇甜高粱地方種（編號：SS2015）、蘇丹草2098和蘇牧3號（擬高粱×蘇丹草雜交種），參照品種在以上引物的擴增片段中至少有一個品種與其他不同。參照品種及相關信息見附錄C。10操作程序10.1樣品準備送檢樣品可為種子、幼苗及其葉片等新鮮組織或器官。種子樣品需扦樣時，應符合GB/T3543.2的規定。每份樣品不少于30個個體植株或種子，等量混合分析，必要時進行個體檢測。10.2DNA提取稱取500mg四葉期幼苗新鮮葉片，用液氮冷凍后迅速磨成粉末；或稱取500mg種子，常溫下研磨成粉末后60目過篩。將幼苗葉片粉末轉入2.0mL離心管中，加入700μL65℃預熱的CTAB提取液后混勻；或稱取100mg過篩種子粉末，加入700μL65℃預熱的SDS提取液后混勻；二者均再加入10μLRNaseA酶溶液（10mg/mL）。水浴或金屬浴65℃加熱45min，每隔15分鐘顛倒混勻一次。加熱取3DB32/TXXXX—2024出離心管，冷卻至室溫（20-25℃)。室溫通風櫥內加入700μL的三氯甲烷:異戊醇混合液（24:1劇烈混勻。室溫10000rpm離心10min，取上清液至1.5ml離心管中。加入-20℃預冷的異丙醇（1倍體積）或無水乙醇（2倍體積）于1.5ml離心管中，輕輕混勻。-20℃靜置1h以上后，室溫12000rpm離心10min，棄上清。75%乙醇漂洗兩次、100%乙醇漂洗一次后，室溫晾干DNA，再加入適量的TE緩沖液溶解于試管中，4℃下保存備用。將DNA原液于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。-20℃下保存備用。注：以上為推薦的DNA提取方法，DNA質量能夠滿足PCR擴增要求的其他DNA提取方法均適用。DNA溶液的紫外吸光度OD260與OD280的比值宜介于1.7~2.0。10.3PCR擴增10.3.1反應體系PCR擴增反應體系的總體積和各組分的終濃度參照表1配制，可以依據試驗條件調整。表1中的緩沖液若含有Mg2+，不再加MgCl2溶液，加等體積雙蒸水替代。表1PCR擴增反應體系--a每一種類的濃度。10.3.2反應程序TD-PCR反應程序1956372955772725min20s20s5min12cycles30cycles4DB32/TXXXX—2024TD-PCR反應程序2956072955472725min20s20s5min12cycles30cycles10.4PCR產物檢測10.4.1瓊脂糖凝膠電泳制膠稱取4g瓊脂糖于三角瓶中并加入100mL的1×TAE緩沖液，微波爐加熱至沸騰后取出，稍冷卻后加入一定量核酸染料（具體用量視核酸染料類型而定搖勻后倒入水平制膠框，插上制樣梳。電泳將膠板安裝于電泳槽上，在電泳正極槽和負極槽各加入適量1×TAE緩沖液，使其沒過點樣孔。移液器吸取6-8μLPCR產物和DL2000DNA分子量標準物。除送檢樣品外，還應同時加入參照品種擴增產物。80V恒壓電泳，電泳時間參考檸檬黃指示帶移動的位置。檸檬黃指示帶在質量分數為4%瓊脂糖膠電泳的移動位置與50bp擴增產物泳動的位置大致相當。通常黃色指示帶到達膠板底部，電泳結束。電泳參考時間分別為1.0h。電泳結束后關閉電源，取出膠板。凝膠成像從膠板中取出瓊脂糖凝膠，放置于凝膠成像系統的顯影板上，依據對應儀器的顯影操作軟件進行影像分析，獲得擴增產物的條帶圖譜及條帶大小。10.4.2熒光毛細管電泳PCR產物樣品準備5DB32/TXXXX—2024吸取帶有6-FAM熒光標記引物的擴增產物1μL，加入基因分析儀配套電泳板中。板中各孔分別加入0.1μL分子量內標LIZ1200和8.9μL去離子甲酰胺，在PCR儀上95℃變性3min，取出后立即置于冰上，冷卻10min以上，瞬時離心10s后備用。等位變異檢測打開基因分析儀，檢查儀器工作狀態和試劑狀態。將裝有樣品的配套電泳板放置于樣品架基座上，打開數據收集軟件，按照基因分析儀使用手冊進行操作。基因分析儀自動運行參數，并保存電泳原始數據文件。10.5數據分析10.5.1數據讀取每個InDel位點的等位變異參照擴增片段大小命名，見附錄C。對于瓊脂糖電泳，將送檢樣品在某一位點擴增片段的遷移位置與對應的參照品種進行比較，確定送檢樣品在該位點的等位變異。對于熒光毛細管電泳，通過參照品種消除不同批次間或者不同型號基因分析儀間可能存在的系統誤差，使用片段分析軟件讀取送檢樣品在該位點的等位變異。純合位點的等位變異數據記為X/X，雜合位點的等位變異數據記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點上的兩個等位變異，小片段數據在前，大片段數據在后。缺失位點的等位變異數據記錄為0/0。示例1：樣品在某個位點上僅出現一個等位變異，為246bp，則該位點的等位變異數據記錄為246/246。示例2：樣品在某個位點上有兩個等位變異，分別為246bp、429bp，則該位點的等位變異數據記錄為10.5.2數據比對將送檢樣品與參照樣品每個位點的等位變異數據逐一比對，按照位點相同、差異、數據缺失、無法判定等情形，記錄每個位點的結果。11結果統計統計比對結果為位點差異的情況，計算差異位點數。12結果判定6DB32/TXXXX—2024當品種間差異位點數＞2，判定為“不同”；當品種間差異位點數≤2，判定為“疑同”；當品種間差異位點數≤2，但存在位點數據缺失或無法判定情形時，不作判定。12.2結果表述差異位點數為，判定為。當存在位點數據缺失或無法判定情形時，表述具體情況。7DB32/TXXXX—2024（規范性）主要儀器設備及試劑A.1主要儀器設備A.1.1PCR擴增儀。A.1.2恒壓電泳儀：最高電壓不低于200V，具有恒電壓和恒電流功能。A.1.3水平電泳槽及配套的制膠附件。A.1.4離心機。A.1.5水平搖床。A.1.6電子天平：感量為0.1g和0.001g。A.1.7微量移液器：規格分別為10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，連續可調。A.1.8磁力攪拌器。A.1.9核酸濃度測定儀或超微量紫外分光光度計。A.1.10微波爐。A.1.11高壓滅菌鍋。A.1.13水浴鍋。A.1.14低溫冰箱。A.1.15制冰機。A.1.16凝膠成像系統。A.1.17基因分析儀：基于毛細管電泳，有片段分析功能和數據分析軟件，最低區分力1bp。A.1.18其他相關儀器和設備。A.2主要試劑除非另有說明，在分析中均使用分析純試劑。A.2.1十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，C19H42BrN，CAS號：57-09-0）。A.2.2十二烷基硫酸鈉（SDS，C12H25SO4Na，CAS號：151-21-3）。A.2.3NP-40：TERGITOL表面活性劑。A.2.4吐溫20（Tween-20，C58H114O26，CAS號：9005-64-5）。A.2.5三氯甲烷（CHCl3，CAS號：67-66-3）。A.2.6異戊醇（C5H12O，CAS號：123-51-3）。A.2.7異丙醇（C3H8O，CAS號：67-63-0）。A.2.8乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O，C10H14N2Na2O8，CAS號：139-33-3）。8DB32/TXXXX—2024A.2.9三羥甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3，CAS號：77-86-1）。A.2.10濃鹽酸（HCl，CAS號：7647-01-0）。A.2.11氫氧化鈉（NaOH，CAS號：1310-73-2）。A.2.1210×PCR緩沖液：含Mg2+25mmol/L。A.2.134種脫氧核糖核苷酸：dATP、dTTP、dGTP、dCTP。A.2.14氯化鈉（NaCl，CAS號：7647-14-5）。A.2.15TaqDNA聚合酶（Taq酶，CAS號：9012-90-2）。A.2.16DL2000DNA分子量標準物：DNA片段分布范圍至少在50bp~2000bp。A.2.17甲酰胺（CH3NO，CAS號：75-12-7）。A.2.18RNaseA酶（核糖核酸酶，CAS號：9001-99-4）。A.2.19核酸染料：SYBRGreen、SYBRSafe、SYBRGold、GelGreen、GelRed任一種均可。A.2.20乙酸（C2H4O2，CAS號：16676-96-3）。A.2.21無水乙醇（C2H6O，CAS號：64-17-5）。A.2.22基因分析儀用丙烯酰胺膠液。A.2.23基因分析儀用分子量內標Liz1200。A.2.23基因分析儀用電泳緩沖液。A.2.24基因分析儀用光譜校準基質。9DB32/TXXXX—2024（規范性）溶液配制試劑配制用水需符合標準GB/T6682的要求。B.1DNA提取B.1.10.5mol/LEDTA溶液186.1gNa2EDTA·2H2O溶于800mL水中，加NaOH溶液調pH至8.0，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min。B.1.20.5mol/LHCl溶液25mL質量分數為36%~38%濃鹽酸，加水定容至500mL。B.1.31mol/LNaOH溶液40.0gNaOH溶于800mL水中，加水定容至1000mL。B.1.41mol/LTris-HCl溶液121.1gTris堿溶于800mL水中，加HCl調pH至8.0，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min。B.1.5CTAB提取液20.0gCTAB、81.7gNaCl、100mL1mol/LTris-HCl溶液和40mL0.5mol/LEDTA溶液，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min，4℃保存。B.1.6SDS提取液5.0gSDS、5mlNP-40、5mlTween-20、10mL1mol/LTris-HCl溶液和10mL0.5mol/LEDTA溶液，加水定容至1000mL，4℃保存。B.1.7TE緩沖液5mL1mol/LTris-HCl溶液和1mL0.5mol/LEDTA溶液，加HCl調pH至8.0，加水定容至500mL，121℃高壓滅菌20min，4℃保存。B.2PCR擴增試劑的配制B.2.1dNTP溶液用TE緩沖液分別配制dATP、dTTP、dCTP、dGTP終濃度為100mmol/L的儲存液。各取20μL混合，加120μLTE緩沖液定容，配制成每種脫氧核糖核苷酸終濃度為10mmol/L的工作液，121℃高壓滅菌20min，-20℃保存。B.2.2InDel引物溶液開蓋前瞬時離心10s，按照說明書加TE緩沖液，分別配制正向引物和反向引物終濃度為100μmol/L的儲存液。取10μL儲存液，加90μLTE緩沖液配制成終濃度10μmol/L的工作液。B.3電泳DB32/TXXXX—2024B.3.110×TAE緩沖液Tris242g、乙酸57.1mL、Na2EDTA·2H2O37.2g，加水定容至1000mL。B.3.21×TAE緩沖液50mL10×TAE緩沖液，加水定容至500mL。DB32/TXXXX—2024（資料性）引物序列及相關信息引物名單及序列見表C.1。表C.1引物序列及相關信息引物編號引物名稱染色體位置引物序列（5'→3'）參照品種InDel位點多態性（bp）BTx623RioTx430紅纓子甜高粱地方種a蘇丹草b蘇牧3號11WS011F:CTCTTGAACACAATTATTGCGTCTTAGTGCR:GCATGGCTGTCTGACTCGACTAATa115021WS021F:CGCAGCAAAGCCAAACGATACTTR:GTGTGGTGGTGTGAGGTTACTCTC241428428428428a42831WS031F:CTCCGGGTTGTGGTAGCTTTR:CACTGCGGAGGATGACCATT778778529529529a77841WS041F:GCTGTGTCCACTCAACGGCTAGR:CACTAATCTATCCATCTAACCACCATTGAC816816816816816b32851WS051F:CATCCTCCTGTGTTCCGTCCR:CTGCTTCGTTTCGGAGGCTA477477477a115362WS061F:TCAAGACATATTGCAGGTTCCTGTTR:TGAGGTCTTCTTTGTTCAAGTTCCA301301259301301a30171WS072F:CGTGAGCGATCATCGGATCAACAAR:ACCTTGGCGTGCCGTGAGAT351296296296296a29681WS082F:TAGTCAGGTGAACAACAGATGGGAACR:CACAAGAAGAGAAATGAATGGACCAAGAAC283496283496496a49691WS092F:AGCATTTGTTCAGCACCTGTCACTAAR:TCTGCTCATGTTCCGGCTAATAACTATACa1321WS102F:CTCCATTGTTGCTCTTCTTCCCTCAAR:AACCCACGGTGGTAAACCTTTGC243243243590590a2431WS112F:GAGTCAAAGGGACACACTTGTTGGTR:CTCCTCTCTTCTTTCCTCCACCTCAA277501277501/a2771WS122F:ACTCCAACTCCGACACCGGCAAR:CATGCAAGTCATTGGACAGGAAGC814814814515515a8141WS133F:AGGATGAGGCGGATTCTTGGR:TCCATAGGCATTCATCGGTC278278355355355a3551WS143F:GAGATGTTAGTTTCTTCCTTGTCCATTGTGR:ATGACTGCTATACAGCCACCCTTCT689418689418689ac418/6891WS153F:CAATATCGTGTCCGTGAACTAGGCR:AGCTCAAAGTGGCTCGTAAGC257529529257529a2571WS163F:TCAACTAACTTGGACGCTTCACCTGR:CGACAGAGCCATGACCACAACC567a195DB32/TXXXX—2024表C.1引物序列及相關信息(續1)引物編號引物名稱染色體定位引物序列（5'→3'）參照品種InDel位點多態性（bp）BTx623RioTx430紅纓子甜高粱地方種a蘇丹草b蘇牧3號2WS173F:CCTCAACTGTGAATTGGTGACGGATATR:TCTACGGTCTTCGTGTCTAGCCTTC426a11412WS183F:TAAGCGGGCTCATTTGTACGAGTCTAR:GGAGAAGAAGAAGCGGTGGAGGT959959644959959a9592WS194F:GCTCAATCATGGGCTAACTAGACTCAAR:ATTTGCCTCTAATTTGCGAGACGAATC209a209201WS204F:GGAAGTCCAACAGCCCACCTCTR:ACCTATCGCCTCCCATGACCTTGa158211WS214F:CTTCCATACTCCATACCACGCTTGTR:CTGTTGGGCATTCTTAACGTCATTACC302302302219219a302221WS224F:TCTCGGTCAGAAGCAAGCCTAACTR:CAGTAGGAAGTCATGTCATCAAGTATGTCT539310310310310a539231WS234F:TTGGTCGGAATTGATGAGACGAATCTTR:CCTCCTCCCTACGAGCAGTAGTAAA435435a435241WS244F:AGAATGAAGGTATGCGCTGTGTR:GAGGAGGAGAAGACGACGACAG263486486486486a486252WS255F:AAGCATCTTGATTAAGGACGGAATGGAR:TACATGCCTTGACAACGAACCTAGC406a190261WS265F:CATGATTGATTGACACGGCACATCTCR:GTTCCGCTTGCCATTCAGCATTATGa123271WS275F:TGGTGCAACTCCTCGCATTTCAAR:GACAACTCGCCATAATAATGTGCTGAG264362362264362a264282WS285F:ATTTCGGAAAGCTTACTCAGAGGGATAR:a879291WS295F:CTTGTGGTGACACGGTATCATACTCTTR:GCCTTCCCTCATCCTAACCTCAAC531531531a170301WS305F:TCCTCCCGAATTAGAAGACGAAACAAAGR:CAGTGAGATACCACATTGGAACTTGAGT211247211247247a211311WS316F:TTCTCTAAGCAACTCAGCAAGTCTCTR:CCGTTCCTTTCCATCCATCCATCA500500500500a149321WS326F:TCCTGTCTATGTGGTTGAAGCCTATAAGR:AATGACTGAAAGGCAACACAGAGAAAC491658658658658a658DB32/TXXXX—2024表C.1引物序列及相關信息(續2)引物編號引物名稱染色體定位引物序列（5'→3'）參照品種InDel位點多態性（bp）BTx623RioTx430紅纓子甜高粱地方種a蘇丹草b蘇牧3號331WS336F:AACACAAGTGGTTGCCTGATGAAGR:CGGATGAGCGATGGAACGAGTT257257257502502a257341WS346F:CGCACCAGTGTCAGCATGTGR:ACGGGCAAGCAAATCTCAATCC597362362362362a362351WS356F:GAGATGGCAATGCAAGAGTCGGR:CCAGGTCAGCAGTGAAGCAAACa128361WS366F:AGAGGCTGACAACCAGGCAGACR:ATACGTAGACAGCACCGCCATCC498a153371WS377F:GGTGATTGTGCAATGTGCATGATATAGACR:ACCACCGCTACACTCGCCAAA885885885a156381WS387F:AATCAAGCTGCAAATGCTATTGGTTCCR:CCGTGGATAACATAAGAATGGTAAGAGTGA298298485298298a298391WS397F:TCCACTGATGACACCATGCCTTCR:TTCATAATGCAGTTCCGCTCACAAG1005a156401WS407F:GGTGCTCCAGAGTTTCCTCAACAR:CCGACTGGTACGGGTACGAGTA300300300300300a348411WS417F:GTGACACTTTAGCACTTTCGTTTGTR:CGGCAGAAGGAGATCACGATACT396396396335335a335421WS427F:ACGCCCATAGCCTTGTTCTCTCAR:ACAGTTTGGTCGAAATTGACGAGACA225225458225225a225431WS438F:ATTCAGGAGAAATATGTGGGCATGTCAR:TTCTGTCGTTTCTACATCTTGGCTTGA422422a184442WS448F:GCCTCCTCGTGAGTTGAGCACTTR:GGACAACAACGGAATCGGTGGTGa256451WS458F:GCATGGAATCTTAACTCTTAGCTTCTCACR:CAATGGACTGGTTCTCGCTTCGT373373373a373461WS468F:GTTCCTGTGGGATGCTTCCTGACR:GCTCCAATATCTGTACTATTTCCTGACCAA418418418a172471WS478F:TTG