色譜法定義色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術，將它用于分析化學并配合適當的檢測手段，就成為色譜分析法。色譜法中，流動相可以是氣體，也可以是液體，由此可分為氣相色譜法（GC）和液相色譜法（LC）。固定相既可以是固體，也可以是涂在固體上的液體，由此又可將氣相色譜法和液相色譜法分為氣-液色譜、氣-固色譜、液-固色譜、液-液色譜。目錄一、液相色譜分析法的發展二、液相色譜分析法的特點三、液相色譜儀四、液相色譜分析法的原理五、高效液相色譜法的主要類型及原理六、高效液相色譜分析法的應用七、分離數據的處理方法八、參考文獻一、液相色譜分析法的發展20世紀初：俄國植物學家茨維特提出經典液相色譜法。經典液相色譜法包括柱色譜、薄層色譜、紙色譜。20世紀60年代末：隨著色譜理論的發展、高效細微固定相的開發、高壓恒流泵及高靈敏度檢測器的應用，高效液相色譜法得到了突破性的發展。

類比液柱色譜法和跑道賽跑其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。外標法適用于工廠中的常規分析。離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。溶劑分子小，故在最后出峰。而ＨＰＬＣ改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；可對相對分子質量在103-105范圍內的化合物按質量分離八、分離數據的處理方法必要時，再根據稀釋倍數、取樣量和標示量折算成為標示量的百分含量，或根據稀釋倍數和取樣量折算成百分含量。王美麗、陳海婷等建立了利用HPLC檢測肉制食品中5種鄰苯二甲酸酯類增塑劑(PAEs)含量的方法。按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液。親和力大，保留時間長；（一）高效液相色譜分析的流程內標法是將一定重量的純物質作為內標物，加到一定量的被分析樣品混合物中，然后對含有內標物的樣品進行色譜分析，分別測定內標物和待測組分的峰面積（或峰高）及相對校正因子，按公式即可求出被測組分在樣品中的百分含量：二、液相色譜分析法的特點在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，實現了分析速度快、分離效率高和操作自動化。兼具分離和分析功能，可以在線檢測。高效液相色譜法的突出特點：1）高壓（150－350*105Pa）2）高速3）高效4）高靈敏度（高靈敏度的檢測器：紫外10-9g，熒光10-11g）三、液相色譜儀（1）三、液相色譜儀（2）四、液相色譜分析法的原理（一）高效液相色譜分析的流程1、由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統，然后輸出，經流量與壓力測量之后，導入進樣器。2、被測物由進樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器，檢測信號由數據處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。3、廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而ＨＰＬＣ改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。四、液相色譜分析法的原理（二）高效液相色譜的分離過程

同其他色譜過程一樣，ＨＰＬＣ也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次交換過程。它借溶質在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。流動相固定相640000031186279流動相固定相分配系數：物質在兩相溶劑中分配平衡時的比例分配系數：1分配系數：33232321616161616168888操作過程圖示

四、液相色譜分析法的原理不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。所以分離最終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。五、高效液相色譜法的主要類型及原理1、液-液分配色譜2、液-固吸附色譜3、離子交換色譜4、離子對色譜5、離子色譜6、排阻色譜7、親和色譜(AC)1、液-液分配色譜

固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學鍵合固定相：將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2、液-固吸附色譜

基本原理：各組分在固定相吸附劑上競爭性吸附與解吸固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。特點：適用于分離相對分子質量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構體有較高選擇性；缺點：非線形等溫吸附，常引起峰的拖尾舉例：

苯乙胺類藥物中重酒石酸去甲腎上腺素注射液的高效液相色譜測定法。

色譜條件與系統適應性試驗：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.14%更烷基磺酸鈉溶液——甲醇(65:35)，用磷酸調節PH值至3.0作為流動相；流速為每分鐘1ml；檢測波長為280nm。理論板數按重酒石酸去甲腎上腺素峰值計算應不低于3000。

反相高效液相色譜法即指流動相的極性大于固定相極性的色譜方法。在本法中常采用化學鍵合相作為固定相，流動相采用水——甲醇或水——乙腈系統，在反相色譜中，極性強的組分在分離時先流出柱子，極性弱的組分后流出。因此適合于共存組分極性差異較大的樣品分析。如高效液相色譜測定硫酸阿托品片的含量。舉例：巴比妥類藥物苯巴比妥、苯妥英和卡馬西平均為臨床上常用的抗癲癇藥，其藥物濃度與療效和毒副反應密切相關。臨床上常將三種藥物同時使用，為提高療效，減少毒副作用與個體差異，為超劑量中毒診斷、治療與及時調整給藥方案提供科學依據，臨床上要進行血藥濃度檢測，而高效液相色譜法是最常用的方法之一。

乙腈(jīng)又名甲基氰，分子式CH3CN，無色透明液體，密度小于水，約為0.79，能與水、乙醇等有機溶劑以任意比混溶，易燃，有毒性。3、離子交換色譜

基本原理：組分在固定相上發生的反復離子交換反應；組分與離子交換樹脂（固定相）之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。親和力大，保留時間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

陽離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；應用：離子及可離解的化合物、氨基酸、核酸等。4、離子對色譜

基本原理：離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。將一種（或多種）與溶質離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質離子結合形成疏水性離子對化合物，控制溶質離子的保留行為使其兩相之間進行分配；陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+X-后；在兩相間分配。舉例：維生素類藥物的分析

維生素具有脂溶性和水溶性兩大類，由于其化學結構和性質相差較大，在含水介質中，又要受到光、空氣、溫度和pH的影響，使測定結果不理想。因而，提出用甲醇和水都能溶解的樟腦磺酸，作為離子對試劑，以二巰基丙烷磺酸鈉0.125g/ml作為抗氧化劑，能使被測樣品處于穩定的初始狀態，結果更為可靠。

反相離子對色譜

是分離有機離子的有效方法，離子對試劑和其他添加劑的選用規則：1.樣品中含有—COOH,—SO3H基團時，選用的離子對試劑應是帶正電荷的有機銨鹽，以增加樣品陰離子在反響色偶中的保留值，選用的流動相一般是甲醇/水；2.除了加入離子對試劑，還要加入磷酸鹽或者其他緩沖液，以控制流動相的酸度；3.樣品中含有—NH2和—NH基團或其他陽離子時，選用的離子對試劑應是烷基磺酸鹽或硫酸鹽；4.樣品同時含有—NH2，—COOH,—SO3H等不同性質的基團時則以上規則選用的離子對試劑和添加劑都合理。舉例：芳酸及其酯類藥物分析合成氨基水楊酸鈉時，以間氨基酚為原料的生產路線較為普遍，因此在成品中可能含有未完全反應的間氨基酚。USP(24)采用離子對高效液相色譜法檢測間氨基酚的限量。色譜條件：填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18,10um)；色譜柱為250mmX46mm；流動相為磷酸二氫鈉液(0.05mol/L)—磷酸氫二鈉液(0.05mol/L)—甲醇(含氫氧化四丁基銨1.9g)(425:425:100)；檢測波長為254nm；流速為1.5ml/min。

5、離子色譜

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無機離子的分析和應用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導檢測器，由于被測離子的電導信號被強電解質流動相的高背景電導信號掩沒而無法檢測。為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機和有機離子的新技術。他們在離子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。

陽離子交換：R—H+Na+OH-

＝R—Na+H2OR—H+Na+Br-

＝R—Na+H+Br-陰離子交換：R—OH+Na+Br-＝R—Br+Na+OH-使具有高背景電導的流動相轉變成低背景電導的流動相，從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術稱為離子色譜。若樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。雙柱型離子色譜裝置圖

離子色譜連續抑制裝置圖6、空間排阻色譜

原理：又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現分離的。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；可對相對分子質量在103-105范圍內的化合物按質量分離7、親和色譜(AC)

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離先在載體表面鍵合上一種具有一般反應性能的所謂間隔臂(環氧、聯胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)

。這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫8、薄層層析色譜是色譜法的一種，是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術，屬固—液吸附色譜，它集柱色譜和紙色譜的優點。一方面適用于少量樣品(幾微克，甚至0.01微克)的分離；另一方面在制作薄層板時，把吸附層加厚加大，因此又可用來精制樣品。此法特別適用于揮發性較小或較高溫度易發生變化而不能用氣相色譜分析的物質。是將吸附劑、載體或其他活性物質均勻涂鋪在平面板(如玻璃板、塑料片、金屬板等)上，形成薄層(常用厚度為0.25毫米左右)后，在此薄層上進行層析分離的方法。此法在雜環類藥物的鑒別實驗中有廣泛應用。

流動相選擇該注意的幾點問題1、盡量使用高純度試劑做流動相，防止微量雜質長期積聚而損壞色譜柱；2、避免流動相與固定相發生相互作用而使柱效下降或損壞柱子；3、試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產生沉淀并在柱中沉積；4、流動相同時還應滿足檢測器的需求。

液相色譜分離類型參考表樣品相對分子量>2000排阻色譜溶于水水為流動相不溶于水非水流動相具有親和性親和色譜小結：分離類型選擇相對分子量<2000不溶于水同系物分配色譜異構體吸附色譜溶于水不離解反相液液色譜可離解陰離子交換色譜陽離子交換色譜離子對色譜離子色譜六、高效液相色譜分析法的應用

由于高效液相色譜具有高速、高效、高靈敏度等特點，近年來，國內外許多專家學者將高效液相色譜技術應用于天然產物（主要是中藥）、農藥和食品等行業中，取得了明顯的效果。下面從實例出發，分析高效液相色譜分析方法在一些方面的應用：1、高效制備液相色譜在天然產物分離中的應用

天然產物（主要是中藥）種類繁多,所含化學成分種類豐富,且有不少結構相似而含量高低不一,采用常規方法難以進行分離、精制。而HLPC的高靈敏性和高效性使其能有效地分離純化某些天然產物中的有效成分。如表2列出的便是其中幾種。已有文獻對利用HLPC分離一些天然產物進行了報道，如黃酮類化合物（如下表所示）、苷類化合物、有機酸類化合物和生物堿類化合物等等。2、液相色譜技術在農藥殘留檢測中的應用

液相色譜法是一種經典的分析方法由于其具有操作簡便分析速度快分離效能高靈敏度高以及應用范圍廣等特點目前農藥殘留物檢測70%采用液相色譜法來進行使用液相色譜法多種農藥可以一次進樣得到完全的分離定性和定量再配置高性能的檢測器使分析速度更快結果更可靠。在王志強、錢允輝、張琰論文中，試驗測定稻米中吡蟲啉農藥殘留，樣品經高速勻漿提取、florisil柱凈化，在269nm波長下，采用高效液相色譜(HPLC)法分離測定。結果表明，吡蟲啉回收率為81.90％~87.80％相對標準偏差在3.24%~4.51%，方法最低檢出限為0.0016mg/kg，該方法的準確性、精確性以及靈敏度均達到農藥殘留分析的要求。3、高效液相色譜在食品行業中的應用

高效液相色譜法在食品化學分析方面的應用已較為普及，林春曉等用HPLC對保健食品中的雌二醇分離測定。王美麗、陳海婷等建立了利用HPLC檢測肉制食品中5種鄰苯二甲酸酯類增塑劑(PAEs)含量的方法。樣品用正己烷提取，C18柱分離，柱溫35℃，乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速1.0ml/min，紫外檢測波長226nm。5種PAEs分離特異性好，在0.02~10微克/毫升之間均具有較好的線性關系，檢出限在4.4~13.8ng/mL之間，高、中、低3水平的回收率均在79.5%~102.0%之間，相對標準偏差均在1.1%~14%之間。該方法適用于肉制食品中鄰苯二甲酸酯類的檢測。高效液相色譜法測定乳制品中三聚氰胺的含量

三聚氰胺(melamine)是一種重要的氮雜環有機化工原料，為白色或無色結晶,通常用于塑料制品中合成樹脂的生產。近年來，一些不法廠商將三聚氰胺添加到奶粉中，以增加蛋白質含量。2008年9月,震驚中外的“三鹿嬰幼兒奶粉事件”暴露出乳制品行業的“潛規則”，國內一些知名乳品品牌也被檢出其產品中含三聚氰胺。因此，如何快速、準確分析乳制品中的三聚氰胺成為多方關關注的問題。胡陽、倪揮等的論文報道了利用高效液相色譜分析方法測定三聚氰胺的含量。（具體實驗步驟見論文）

內標法是色譜分析中一種比較準確的定量方法，尤其在沒有標準物對照時，此方法更顯其優越性。內標法是將一定重量的純物質作為內標物，加到一定量的被分析樣品混合物中，然后對含有內標物的樣品進行色譜分析，分別測定內標物和待測組分的峰面積（或峰高）及相對校正因子，按公式即可求出被測組分在樣品中的百分含量：按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量進樣，記錄色譜圖。八、分離數據的處理方法

用含對照品和內標物的對照溶液所得色譜峰響應值，按下式算出校正因子f=(As/ms)/(Ar/mr)其中As和Ar分別為內標物和對照品的峰面積或峰高，ms和mr分別為加入內標物和對照品的量。再取各品種項下含有內標物的待測組分溶液進樣，記錄色譜圖，再根據含內標物的待測組分溶液色譜峰響應值，計算含量mi=f×Ai/(As/ms)其中Ai和As分別為供試品和內標物的峰面積或峰高，ms為加入內標物的量。必要時，再根據稀釋倍數、取樣量和標示量折算成為標示量的百分含量，或根據稀釋倍數和取樣量折算成百分含量。注意事項

采用內標法定量時，內標物的選擇是一項十分重要的工