關于熒光原位雜交技術原位雜交技術簡介

insituhybridization原位雜交技術的基本原理是根據核酸分子堿基互補配對的原則，將有放射性或非放射性標記的外源核酸（探針）與經過變性后的單鏈DNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，再經一定的檢測手段將待測核酸在染色體、細胞或組織上的位置顯示出來的一項技術。該技術最早是PardueandGall(1969)和Johnetal.(1969)分別獨立建立起來的。當時使用的放射性標記探針，利用放射自顯影檢測一些高度重復序列DNA在染色體上的定位，此后原位雜交技術日益成為生物醫學領域的一種十分重要的技術手段。盡管放射性標記探針靈敏度很高，能夠檢測小至幾百個堿基對的DNA序列，但是由于同位素的安全問題、半衰期、信號統計等限制了此項技術的廣泛應用，后來逐漸發展出了非放射性標記探針原位雜交技術。第2頁,共38頁，星期六，2024年，5月原位雜交操作步驟一、準備載玻片和固定材料二、染色體標本制備和預處理三、探針制備及標記四、染色體標本變性五、雜交六、雜交后洗脫七、免疫細胞化學檢測八、熒光顯微鏡觀察及顯微攝影第3頁,共38頁，星期六，2024年，5月染色體標本制備第4頁,共38頁，星期六，2024年，5月預處理1、RNA酶處理

1）每張玻片加100μl100μg/mlRNaseA(in2xSSC)37℃處理1小時2）用2xSSC洗3×5min3）70%，80%，100%乙醇系列脫水，每級5分鐘2、胃蛋白酶處理

1）0.005-0.02%pepsin（10mMHCl）37℃處理10min2）1×PBS洗2×5min3）1×PBS，50mMMgCl2處理5min4）1×PBS，50mMMgCl2,1%甲醛固定10min5）PBS洗滌并脫水,氣干第5頁,共38頁，星期六，2024年，5月非放射性標記法直接法熒光素（fluorescein）或其他熒光染料間接法地高辛（digoxigenin）生物素（biotin）1.隨機引物法2.缺口平移法3.PCR法4.寡核苷酸末端標記法5.直接在探針3’或5’端合成第6頁,共38頁，星期六，2024年，5月1.0.5ml離心管中加入1ug探針DNA,加水置體系為16ul2.沸水浴中變性10min,馬上置于冰水中3.加入4ulDIG-High

Prime(5xbuffer;50%glycerol;1U/μlKlenowenzyme;5xrandomprimermix;1mMeachofdATP,dCTP,anddGTP;0.65mMdTTP;and0.35mMDIG-11-dUTP)4.混勻離心，置于37℃溫育1小時~20小時5.65℃處理10min終止反應第7頁,共38頁，星期六，2024年，5月染色體標本變性共變性雜交液加到標本上封片，置80℃烘箱中10分鐘分別變性70%甲酰胺，2xSSC70℃處理2分鐘70%，85%，100%冷乙醇系列脫水，空氣干燥第8頁,共38頁，星期六，2024年，5月1.雜交液(50%去離子甲酰胺,2xSSC,10%硫酸葡聚糖,50mM磷酸鈉;pH7)中加入標記的探針，每10ul雜交液含50ng探針2.探針95℃變性5分鐘，置冰水中10分鐘3.10ul雜交液加到標本上，蓋蓋玻片并封片4.濕盒中37℃雜交過夜雜交第9頁,共38頁，星期六，2024年，5月1.2xSSC,50%甲酰胺45℃洗3x5min2.2xSSC37℃洗2x5min3.TNTbuffer[100mMTris-HCl(pH7.5),150mMNaCl,0.05%Tween20]37℃洗1x5min雜交后洗脫第10頁,共38頁，星期六，2024年，5月1.TNTbuffer沖洗2.TNBbuffer[100mMTris-HCl(pH7.5),150mMNaCl,0.5%blockingreagent]3.Anti-DIG-熒光素(2μg/ml,inTNB)37℃30min4.TNTbuffer沖洗3x5min5.乙醇系列脫水,氣干6.DAPI染色10min7.加Vectashield封片,熒光顯微鏡下觀察并照相免疫細胞化學檢測第11頁,共38頁，星期六，2024年，5月影響雜交的因素一、影響雜交的主要因素溫度、pH、單價陽離子濃度、甲酰胺二、其他因素探針長度、探針濃度、硫酸葡聚糖、洗脫嚴謹度三、標準雜交條件第12頁,共38頁，星期六，2024年，5月第13頁,共38頁，星期六，2024年，5月FISH技術的應用基因定位染色體結構變異(異位、缺失、重復)研究染色體物理作圖疾病及產前診斷外源基因檢測多倍體起源進化研究分子核型研究染色體（質）空間結構研究第14頁,共38頁，星期六，2024年，5月熒光原位雜交技術新進展M-FISH，armFISH(42-colorM-FISH),SKYBAC-FISH,YAC-FISHFiber-FISHPRINS(PrimedinsituDNAsynthesis)引物原位DNA合成技術IS-PCR(in

situpolymerasechainreaction)原位PCRGISH(GenomeinsituHybridization)基因組原位雜交Immuno-FISH3D-FISHQ-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISHT-FISH（Tissue-FISH）or(Telomere-FISH)RNA-FISH第15頁,共38頁，星期六，2024年，5月第16頁,共38頁，星期六，2024年，5月

ChromosomeLab5種熒光素聯合標記人類24條染色體

熒光素12345678910111213141516171819202122XY

FITC☆☆☆☆☆☆☆☆☆☆☆

Cy3△△△△△△△△△△

Cy3.5○○○○○○○○○○○

Cy5※※※※※※※※※※

Cy7◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆

第17頁,共38頁，星期六，2024年，5月第18頁,共38頁，星期六，2024年，5月第19頁,共38頁，星期六，2024年，5月

光譜核型分析（spectralkaryotyping,SKY)SKY是另一種M-FISH,實驗操作和結果與M-FISH相似。原始圖像利用干涉儀產生干涉信號，再采用高性能CCD數碼相機進行拍攝，得到一組不同光程差的干涉圖像。再將所得數據做FFT(快速傅立葉變換),得到每一點的光譜信息。通過分析光譜信息，發現原始圖像的信息。第20頁,共38頁，星期六，2024年，5月

ChromosomeLab干涉儀鏡子收集光線標本發射光譜CCD相機傅立葉轉換分析光譜信息通過光譜分析準確分析A圖中的色彩分為相近的三種染色體（C圖）第21頁,共38頁，星期六，2024年，5月

ChromosomeLab該技術操作簡單，只需進行一次雜交，一次拍攝，而傳統M-FISH在拍攝過程中要變換多次濾光片。該技術靈敏度高，由于摒棄了傳統M-FISH采用的以濾光片為基礎的成像技術，在拍攝過程中全光譜通過，因此光通過量大大提高，從而提高靈敏度。分析準確率高，整個分析基于光譜信息，所以準確率極高，即使是染色體末端的微弱信號，也同樣可以采集到。第22頁,共38頁，星期六，2024年，5月

ChromosomeLab利用SKY技術，準確判斷出7號染色體和12號染色體之間的交叉易位。第23頁,共38頁，星期六，2024年，5月

ChromosomeLabG帶分析得到一條marker染色體無法確認起源，用SKY確定來源于18號。第24頁,共38頁，星期六，2024年，5月

ChromosomeLabFiber-FISH

DNA纖維的制備是先將單細胞懸浮液涂在載玻片上，然后利用堿變性劑或EDTA-SDS緩沖液等化學方法將染色體的結構破壞，讓DNA分子與復合的蛋白質分離而形成游離的DNA纖維，再以這種失去空間結構的線性DNA分子作為靶DNA的載體進行原位雜交，使分辨率和靈敏度都有了很大的提高。第25頁,共38頁，星期六，2024年，5月

ChromosomeLab在不同靶DNA上熒光原位雜交技術的比較靶DNA結構分辨率水平可檢測DNA優點和缺點序列范圍中期染色體1——3Mb>1Mb保持染色體結構，切片容易制備分辨水平低，識別染色體困難前期染色體200Kb>200Kb保持染色體結構,分辨水平居中切片不易制備,識別染色體困難拉長的中期染色體200Kb>200Kb保持染色體著絲點端粒結構，分辨率水平居中，拉長染色體不均勻粗線期染色體100Kb>100Kb保持染色體結構，識別染色體可能，分辨率水平較高，切片不易制備間期細胞核50Kb50Kb-2mb分辨率水平高，切片容易制備，無染色體結構，游離染色質絲10Kb10Kb-1mb分辨率水平高，無染色體結構DNA纖絲1Kb1Kb-1mb分辨水平高，無染色體結構第26頁,共38頁，星期六，2024年，5月第27頁,共38頁，星期六，2024年，5月第28頁,共38頁，星期六，2024年，5月基因組原位雜交（GISH）第29頁,共38頁，星期六，2024年，5月RNA-FISH第30頁,共38頁，星期六，2024年，5月T-FISH第31頁,共38頁，星期六，2024年，5月蠶豆紅小豆黃豆豇豆綠豆第32頁,共38頁，星期六，2024年，5月小麥水稻玉米第33頁,共38頁，星期六，2024年，5月金