CCSB41牛呼吸道合胞體病毒實時熒光RT-PCR檢測方法Real-timeRT-PCRmet中國獸醫協會發布IT/CVMA145—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由湖南冠牧生物科技有限公司提出。本文件由中國獸醫協會歸口。本文件起草單位：湖南冠牧生物科技有限公司、上海市動物疫病預防控制中心、中國動物疫病預防控制中心、江西省農業生態與資源保護站、長沙海關檢驗技術中心、遼寧省動物疫病預防控制中心、榆林市農業宣傳信息中心。本文件主要起草人：楊忠蘋、王濤、馬麗、肖金年、楊德全、奉佳、陳桂平、禹思宇、劉林青、蘭德松、白艷艷、李鑫。1T/CVMA145—2024牛呼吸道合胞體病毒實時熒光RT-PCR檢測方法本文件描述了用實時熒光RT-PCR法檢測牛呼吸道合胞體病毒。本文件適用于牛鼻拭子、血樣以及肺臟組織等樣品中牛呼吸道合胞體病毒核酸的檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。實時熒光RT-PCR：實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應（Real-timefluorescencereversetranscriptpolymerasechainreaction）BRSV：牛呼吸道合胞體病毒（Bovinerespiratorysyncytialvirus）BHQ：無熒光淬滅基團（Blackholequencher）Ct值：每個反應管內的熒光信號量達到設定的閾值所經歷的循環數（Cyclethreshold）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）FAM：羧基熒光素（Carboxyfluorescein）HEX：六氯-6-甲基熒光素（Hexachlorofluorescein）PBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebufferedsaline）RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApoiymerase）TEBuffer：Tris-EDTA緩沖液（Tris-EDTAbuffersolution）2T/CVMA145—20245原理本文件采用了TaqMan探針實時熒光RT-PCR技術原理。反應體系中包括一對用于擴增的引物和一條能與PCR產物特異雜交的熒光標記探針。探針的5′端標記了熒光報告基團，3′端標記了淬滅基團。在進行RT-PCR延伸反應時，首先將一條RNA鏈逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板經過PCR進行DNA復制，Taq酶的5′外切酶活性將5′端熒光基團從探針上切割下來，使其與淬滅基團分離，從而儀器能檢測到5′端熒光基團所發出的熒光信號，一分子PCR擴增產物的生成伴隨一分子熒光信號的產生。隨著擴增循環次數的增加，儀器檢測到的熒光信號的累積反映了擴增產物量的變化。本文件以BRSV的M基因序列為基礎設計合成了一對特異性引物及探針達到檢測BRSV病原核酸的目的，同時在體系中引入人工合成的外源DNA片段作為外源內標，有效監控因試劑失效、操作錯誤、樣本中存在PCR抑制物等原因帶來的假陰性結果，建立了牛呼吸道合胞體病毒實時熒光RT-PCR反應體系。6試劑和材料6.1試劑6.1.1除非另有說明，所用試劑均為分析純，試驗用水符合GB/T6682的要求，所有試劑均用無RNA酶的容器分裝。6.1.2FastKing一步法反轉錄-熒光試劑盒（探針法），含RT-PCR擴增所需的逆轉錄酶、Taq酶、buffer、Mg2+、dNTPs等組分。6.1.3TEBuffer(pH8.0)：配制方法按照附錄A中A.1配制。6.1.4陽性對照、陰性對照、外源內標按照A.2、A.3和A.4配制，陽性對照質粒和外源內標質粒序列見附錄B中B.1和B.2。6.2引物和探針實時熒光RT-PCR擴增BRSV病原M基因及外源內標基因用上、下游引物和探針序列按附錄C中C.1設計合成。7儀器設備7.1熒光PCR儀。7.2組織勻漿器。7.3冷凍離心機。7.4振蕩器。7.5微量移液器（量程：0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μL～200μL和200μL～1000μL）。7.6冰箱（2℃~8℃、?20℃以下及?70℃以下）。7.7高壓滅菌鍋。7.8全自動核酸提取設備（選用）。3T/CVMA145—20248樣品的采集與處理8.1通則實驗室生物安全要求應符合GB19489。8.2采樣器材采樣拭子、剪刀、鑷子、5mL采樣管、一次性采樣袋、一次性采血器或注射器，采樣杯，PBS。拭子、采樣袋外，上述采樣工具應經121℃±2℃,15min高壓滅菌并烘干或經160℃干烤2h。8.3樣品采集8.3.1鼻拭子用無菌棉拭子采集牛鼻道分泌物，采集時，將拭子反復刮擦牛鼻道分泌物，蘸取分泌物后，立即將棉拭子浸入1mL～2mL滅菌0.01mol/LpH7.2的PBS中，溶液配制方法按A.5進行。4℃儲存，盡快送達實驗室。8.3.2血樣牛常用頸靜脈采血，采血時先用鑷子夾取碘伏棉球對采血部位由里向外做點狀螺旋式消毒，待干燥后采血。用一次性采血器或注射器，用針頭（一般用三棱針）穿刺靜脈后，將血液滴到直徑為3mm～4mm抗凝管（EDTA抗凝劑）內（長度為4cm-6cm），并立即連續搖動后將口封好，豎立存放。8.3.3肺臟組織采集牛肺臟組織時，如已死亡的動物盡快采集，夏天不超過2h，冬天不超過6h（還要視具體溫度）。采集的動物病料應新鮮，盡可能減少污染，并盡快送實驗室檢驗。8.3.4其他樣品按照NY/T541-2016獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范的規定執行。8.4樣品保存與運輸上述采集的樣品需盡快用于檢測；如不能立即檢測的樣品，在2℃~8℃下保存應不超過24h，?20℃±5℃下應不超過3個月，?70℃下應不超過1年。樣品運送采用低溫保存進行運輸，并在規定溫度下的保存期內送達。8.5樣品處理8.5.1鼻拭子取樣進行檢驗時，振蕩器振蕩混勻30s，4℃4000r/min離心1min，取上清用于后續核酸提取。8.5.2血樣無需處理直接用于后續核酸提取。4T/CVMA145—20248.5.3肺臟組織取樣進行檢驗時，用無菌剪、鑷取適量樣品按1：5的比例加入滅菌0.01mol/LpH7.2的PBS或生理鹽水（例如：1g組織樣品加5mLPBS或生理鹽水）。使用組織勻漿器研磨，后分裝到離心管中，凍融2次～3次4000r/min離心5min，取上清用于后續核酸提取。9操作方法9.1擴增試劑的準備與配制9.1.1在試劑儲存和準備區進行。9.1.2每個反應的體系按照C.2配制，根據所需反應數n，按n＋1配制反應液，充分混勻后分裝，每個反應管20μL。轉移反應管至樣本制備區。9.2樣品核酸提取9.2.1在樣本制備區進行。使用商品化病毒基因組RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA，也可采用其他等效的RNA提取方法。9.2.2實驗前準備（使用當天準備，可選）：取出吸附柱（已套好收集管），加入250μL平衡液（Na和純化水），12000r/min離心1min，棄收集管中廢液，將吸附柱重新放回收集管中備用。9.2.3取1.5mL離心管，依次加入500μL裂解液和250μL待測樣本和10μL蛋白酶K，漩渦混勻，瞬時離心，室溫靜置5min。9.2.4將步驟9.1.3中的混合液全部轉移至吸附柱中，12000r/min離心1min，棄收集管中廢液，將吸附柱重新放回收集管中。9.2.5向吸附柱中加入800μL洗滌液A（純化水，Tris,氯化鈉，無水乙醇等），12000r/min離心1min，棄收集管中廢液，將吸附柱放入收集管中。9.2.6向吸附柱中加入800μL洗滌液B（純化水，Tris,氯化鉀，無水乙醇等），12000r/min離心1min，棄收集管中廢液，將吸附柱放入收集管中。9.2.7重新將吸附柱安置于收集管上，12000r/min離心1min，除盡殘留洗液，否則洗滌液中的乙醇會影響后續實驗。9.2.8丟棄收集管，將吸附柱放入一個干凈的1.5mL離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50μL~80μL洗脫液（對于雜質、抑制物較多的復雜樣本，宜將洗脫液預熱至65℃后使用），室溫放置2min，12000r/min離心1min，丟棄吸附柱，1.5mL離心管中液體即為提取的核酸產物。可直接用于檢測或保存于?20℃備用。9.3加樣9.3.1在樣本制備區進行。9.3.2在9.2.2的反應管中分別加入9.1.8中提取的RNA溶液，以及陰性對照和陽性對照各5μL，使每管總體積達到25μL，記錄反應管對應的樣品編號。蓋好管蓋，振蕩或搖晃混勻后，3000r/min離心30s。轉移至擴增區。9.4實時熒光RT-PCR反應9.4.1在擴增區進行。應使用能采集并區分FAM和HEX這兩種不同熒光信號的多通道熒光PCR儀。5T/CVMA145—20249.4.2將9.3.2中加樣后的反應管放入熒光PCR檢測儀中，編輯樣品表后選定FAM檢測通道讀取BRSV檢測結果；選定HEX檢測通道讀取外源內標檢測結果，淬滅基團均選擇無（None）熒光。之后如下設置反應參數：——第一階段，反轉錄50℃15min；——第二階段，預變性95℃2min；——第三階段，95℃15s，60℃30s，40個循環，在第三階段每個循環的退火延伸收集熒光信號，試驗結束后，根據收集的熒光曲線和Ct值判斷結果。10結果判定10.1結果分析條件設定閾值設定原則：閾值線設定于剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點。不同儀器可根據儀器噪聲情況進行調整。10.2試驗成立的條件10.2.1陰性對照：HEX通道Ct≤35，呈典型擴增曲線，且FAM通道無Ct值，無典型擴增曲線。10.2.2陽性對照：HEX通道Ct≤35，呈典型擴增曲線，且FAM通道Ct值≤35，呈典型擴增曲線。10.2.310.2.1和10.2.2要求需在同一次試驗中同時滿足，否則，本次試驗無效，需重新進行。10.3結果描述及判定10.3.1被檢樣品HEX通道Ct≤35，呈典型擴增曲線，且FAM通道無Ct值，無典型擴增曲線，判定樣品中BRSV核酸陰性。10.3.2被檢樣品HEX通道Ct≤35，呈典型擴增曲線，且FAM通道Ct≤35，呈典型擴增曲線，判定樣品中BRSV核酸陽性。10.3.3被檢樣品HEX通道Ct≤35，呈典型擴增曲線，且FAM通道35<Ct≤40，判定結果可疑，應進行重復試驗。如果重復試驗FAM通道Ct≤40，且典型擴增曲線，判定樣品中BRSV核酸陽性，Ct值>40或無Ct值判定為陰性。10.3.4被檢樣品HEX通道Ct＞35，說明此次樣本檢測結果無效，需重復進行試驗。6T/CVMA145—2024溶液配制A.1TEBuffer(pH8.0)量取下列溶液于500mL燒杯中，1MTris-HClBuffer(pH8.0)5mL，0.5MEDTA(pH8.0)1mL，向燒杯中加入約400mLddH2O均勻混合；將溶液定容到500mL后；進行無菌過濾，室溫保存。A.2陽性對照用500μLTEBuffer(pH8.0)將含BRSV檢測目標片段的質粒進行溶解和10倍梯度稀釋，用本文件方法測定FAM通道Ct值，選擇值在20～25之間的稀釋倍數作為陽性對照。A.3陰性對照為滅菌生理鹽水：稱取0.9g氯化鈉，溶解在少量蒸餾水后，定容到100mL，高壓滅菌后作為陰性對照。A.4外源內標用500μLTEBuffer(pH8.0)將含人工合成的DNA外源內標片段的質粒進行溶解和10倍梯度稀釋，用本文件方法測定HEX通道Ct值，選擇值在20～25之間的稀釋倍數作為外源內標。A.50.01mol/LpH7.2的PBSA液：0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)27.6g，溶于蒸餾水中，最后稀釋至1000mL。B液：0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液：磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)71.6g，加蒸餾水溶解，最后稀釋至1000mL。0.2mol/LA液14mL，0.2mol/LB液36mL，加氯化鈉(NaCl)8.5g，用蒸餾水稀釋至1000mL。7T/CVMA145—2024陽性對照質粒序列B.1陽性對照質粒序列TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCtgcatatctagagaaagagagcatatattatgtaactacaaattggaaacacacggccactaaattctccattaagcctatagaggactgattctcacacaacttatcttaacacaacagaAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGC8T/CVMA145—2024GTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCB.2外源內標質粒序列TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCctggtacatggcggcgaataacagcatccagggccattcagatgtcggagacatcagcttctcgccgagAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTG