ICS07.080細胞純度測定通用要求流式細胞測定法國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會GB/T39729—2020 I Ⅱ 3術語、定義和縮略語 4方法原理 5通用要求 2 25.2儀器設備 5.3樣本制備 35.4試驗步驟 5.5數據分析 55.6方法確認 5 5參考文獻 6IGB/T39729—2020本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由國家標準物質研究中心提出并歸口。ⅡGB/T39729—2020細胞純度是評價和分析細胞樣本特性與細胞產品質量的基本參數，因此醫學檢驗、生物醫藥研發、生產和質量檢驗等領域需要廣泛開展細胞純度的測量。流式細胞術可對液體中懸浮單顆粒或細胞進行條件之間的數據一致性，需要對通過流式細胞術進行細胞純度試驗的技術環節標準化。1GB/T39729—2020細胞純度測定通用要求流式細胞測定法本文件適用于研究、生產與檢驗中通過流式細胞儀進行的細胞純度的測定。2規范性引用文件本文件沒有規范性引用文件。3.1術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1.1目標細胞celloftestingtarget3.1.2細胞純度cellpurity目標細胞占樣本總細胞數量的百分率。3.1.3細胞特定成分與熒光染料或標記了熒光染料的特異性抗體結合后進行檢測的一種技術。3.2縮略語下列縮略語適用于本文件。FSC:前向角散射光(ForwardScatter)SSC:側向角散射光(SideScatter)4方法原理使用流式細胞儀，通過總細胞和目標細胞不同的光學(散射光和熒光)特性，對待測樣本中的總細胞和目標細胞進行區分和計數。根據總細胞和目標細胞的測量數量，計算得到目標細胞純度。2GB/T39729—20205通用要求選擇的熒光染料應能被試驗所用流式細胞儀的激光器激發，其激發光信號能被流式細胞儀的檢測器接收。確保選擇的熒光染料標記的抗體對目標細胞具有特異性。要求。5.1.4緩沖溶液固定劑不應造成待測細胞染色后的光學特性和形態嚴重改變。熒光補償樣品為單熒光染色細胞或者熒光補償微球。熒光補償樣品的熒光染料應與待測細胞所用的熒光染料一致。熒光補償樣品的熒光強度至少要與待測細胞一致，或者超過待測細胞的熒光強度。5.2儀器設備具有熒光檢測通道和散射光檢測通道，熒光通道能夠檢測選擇的熒光染料，散射光檢測通道包括微量移液器量程為10μL～1000μL。微量移液器應經過檢定或校準，并定期核查其移取量的準確度和精密度。渦旋振蕩器使用的渦旋轉速不應大于3000r/min。使用者應監測并記錄渦旋振蕩器的使用轉速、時長等條件。3GB/T39729—2020的溫度準確性和穩定性。5.3樣本制備根據原始樣本的類型選擇合適的待測樣本制備方式。待測樣本應是單分散細胞懸液，即待測樣本中的細胞以單個細胞存在，沒有細胞團或細胞碎片。運送條件不應影響待測細胞的生物特性和檢測結果。5.3.3標識待測樣本應具有標簽，標簽上注明樣本類型、樣本采集和制備的時間和地點。細胞染色前，應根據流式細胞儀的性能參數、待測細胞的黏附、自然沉降等特性來調整樣本中的細胞濃度。如果細胞濃度過高，可用緩沖溶液對待測樣本進行稀釋，并記錄稀釋倍數。根據熒光染料或特異性的熒光染料標記抗體質量參數確定樣本量及染料、抗體濃度、孵育條件。保證待測樣本和熒光染料或特異性的熒光染料標記抗體充分混合，應選擇合適的渦旋轉速和時長，轉速過高或時間過長會造成細胞破損。待測樣本完成細胞染色后，應盡快進行上機檢測。如果無法盡快上機檢測，應通過固定劑進行固定并適當條件保存，宜4℃~8℃避光保存。5.4試驗步驟應根據流式細胞儀的儀器說明書設置儀器的工作條件，包括環境溫度、濕度、電源電壓、大氣壓力、環境光照等。5.4.2開機校驗每次開機后，對流式細胞儀的光路系統進行校驗，可參考流式細胞儀的校驗參數檢測FSC、SSC和各熒光通道的平均熒光強度、變異系數和熒光分辨率。案是否正確。使用不含任何熒光染料的待測細胞樣本作為陰性對照。使用已經證明可有效地與待測熒光染料結合的細胞樣本作為陽性對照。使用與熒光染料標記的抗體相同種屬來源、同種免疫球蛋白的相同亞型的相同劑量抗體染色的細胞樣品作為同型對照。使用兩個和兩個以上的熒光染料或熒光染料標記抗體組合標記細胞樣本時，在完整的染色基礎上4CountCount使用減少一種熒光染料或熒光染料標記抗體進行細胞染色的待測細胞樣本作為熒光扣除對照。進樣間隔期間，應使用清洗液對儀器管道進行清洗。選擇合適的檢測通道后，根據使用的熒光染料或相關試劑盒提供的質量參數設置系列雙參數散點圖或單參數直方圖和閾值。根據陰性對照、陽性對照的FSC、SSC和熒光信號的強弱調整電壓大小。通過調整電壓使陰性對照、陽性對照的細胞FSC、SSC信號與細胞碎片或雜質分開處于對應散點圖中部，見圖1。20002004006008001FSC圖1流式分析圖譜中細胞FSC/SSC信號示意圖通過調整電壓使陽性對照的熒光信號處于雙參數散點圖(見圖2a)]中對應熒光通道強度軸閾值的上方，或單參數直方圖[見圖2b]]中對應熒光強度軸閾值的右方；陰性對照的熒光信號處于雙參數散點圖中對應熒光通道強度軸閾值的下方，或單參數直方圖中對應熒光強度軸閾值的左方，見圖2。CID3-KO400-400-300-Q12000C14-FITCa)雙參數散點圖b)單參數直方圖標引序號說明：Q1——陰性對照；圖2流式分析圖譜中陰性/陽性對照的熒光通道信號類群區分示意圖采用兩種及以上染料組合方案進行細胞計數時或光學檢測通道的電壓及增益發生變動時，應進行熒光補償。熒光補償樣品進樣完成后，根據儀器操作軟件的指示進行手工方式補償或自動補償。5GB/T39729—20205.4.3.5目標細胞設門使用同型對照和熒光扣除對照進行對比，通過相應散點圖中的熒光強度表達，從陽性對照的熒光信號中區分出目標細胞的陽性信號并進行設門。5.4.3.6信號采集應在進樣穩定后開始采集信號。總細胞信號采集數量不應小于10000,目標細胞信號采集數量不應小于1000個。若總細胞信號采集數量為10000時，不能獲取1000個目標細胞采集數量，可加大總細胞信號采集數量。信號采集時間應保持在合理范圍內，過長時間可能導致細胞發生聚集或沉降。5.5數據分析按照公式(1)計算目標細胞純度： (1)P——目標細胞純度；N,——目標細胞數量，單位為個；Nt——總細胞數量，單位為個。5.6方法確認應對具體測量方法進行方法性能確認。方法性能參數包括準確度、精密度、工作范圍(檢出限、線性范圍等)、特異性、方法穩健性和組間精密度(如操作者間、儀器間和日間變化)等。可建立評估方法性能參數的方案和標準，制定并保存相應的文件。5.7報告報告提供的信息應至少包括：a)使用儀器信息，包括儀器的參數設定；c)測量結果；d)數據分析程序；e)意外情況。6G