1貓呼吸道癥候群病原分子快速診斷重組酶介導鏈替換核酸擴增法本文件規定貓呼吸道癥候群重組酶介導鏈替換核酸擴增法(GB/T6682分析實驗室用水規GB/T27401實驗室質量控制規范NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范貓杯狀病毒：felinecaliciviru貓杯狀病毒屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)水皰疹病毒屬病毒(Vesivirus)病毒貓皰疹病毒：felineherpesvi貓皰疹病毒屬皰疹病毒科，甲型皰疹病毒亞科病毒，外有囊膜，雙股的DNA，于細胞核內進行增貓支原體：felinemycoplas體攝入細胞內，主要引起貓支原體肺炎、上呼吸道感染和慢性支氣2貓波氏桿菌：bordetellabronchisep貓波氏桿菌是一種需氧革蘭氏陰性菌,主要影響貓的呼吸道系統，出現流鼻涕、打噴嚏咳嗽呼酶，在恒溫下(一般為37℃~42℃),該重合蛋白SSB的幫助下，打開模板DNA的雙鏈結構，當引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補序列時，在DNA聚合酶的作用下，邊轉錄邊形成新的DNA互補鏈，擴增產物以指數級增長。利用熒光探針的標記，隨著RAA反應的進行，RAA產物與熒光信號的增長呈一種重組酶介導鏈替換的恒溫核酸快速擴增技術(簡稱RT-RAA技術)。利用從細菌或真菌中獲得的重組酶，在恒溫下(一般為37℃~42℃),該重組酶可與引物緊密結合，形成酶和引物的聚合體，在單鏈DNA結合蛋白SSB的幫助下，打開模板DNA的雙鏈結構，當引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補序列時，在逆轉錄酶和DNA聚合酶的作用下，邊轉錄邊形成新的DNA互補鏈，擴增產物以指數級增長。利用熒光探針的標記，隨著RAA反應的進行，RAA產4符號和縮略語A——260nm處的吸光值N——核酸稀釋倍數3BS-RecA：枯草芽孢桿菌重組酶(Bacillussubtilisrecombinase)Bsu：枯草芽孢桿菌(BacillussubDNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）RNA：核糖核酸（ribonuleicacid）RT-RAA：反轉錄重組酶介導擴增（Reversetranscription-recombinase-aidamplificaSC-RecA：天藍色鏈霉菌重組酶（Streptomyce參照NY/T541—2016中6.12眼部組織和和分泌物樣品、6.19呼吸道后的DNA/RNA為模板，分別采用貓杯狀病毒、貓皰疹病毒、貓支原體、貓衣引物和探針進行實時熒光RAA/RT-RAA擴增，根據實時熒光的增幅情況，實現對貓呼吸道癥候群病原貓皰疹病毒實時RAA熒光檢測所用的引物探針參見附錄貓支原體實時RAA熒光檢測所用的引物探針參見附錄貓衣原體實時RAA熒光檢測所用的引物探針參見附Na?EDTA。7.5TE緩沖液(pH8.0)：10mmol/LTris-H4逆轉錄酶，250mmol/LTricine，12.5mmol/振蕩混勻后于70℃孵育15min，期間顛倒離心管2-3次；12000r/min離心5m4℃靜置30min，4℃下12000r/min離心3min，小心棄去上清液；加入700μL70%乙醇,重懸沉淀，12000或-80℃凍存備用。9.3.1RT-RAA擴增反應總體系貓杯狀病毒實時逆轉錄熒光擴增反應總體系5貓皰疹病毒/貓支原體/貓衣原體/貓波氏桿菌實時逆轉錄熒光擴增反應總體系見附錄9.5實時熒光RAA/RT-RAA擴增反應RAA擴增靈敏度高使得其容易污染導致假陽性，因此應高度重視擴增產物的污染問題，反應過程檢測過程中防止交了污染的措施按照GB/T27401規7A.1貓杯狀病毒RT-RAA引物序列名稱引物/探針序列(5'→3')擴增片段長度靶基因貓杯狀病毒F:TTTGGAGCATTACAACAGCCAGTTTAATGGORF1R:AATATTTAAGCACGTTAGCGCAGGTTGAGP:ATTCGAGTGGCATGACCGCCCTACACTGTGA[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]GTTCGAAGTTTGAG-C3注：目的基因序列參見附錄D.1。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，FAM-dT,THF,BQH-dT和C3spacer均為探針修飾基團。A.2貓皰疹病毒RAA引物序列名稱引物/探針序列(5'→3')擴增片段長度靶基因貓皰疹病毒F:AATGCTATACTGGCGTAGTCTCTTTGAAA247bpTKR:GGCGAGAGGGTGTCTATCTATGATTAGGGP:GTCTCTTTGAAACTGATGTTGTCGGTGG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]CTATGCCGTCCAGGA-C3注：目的基因序列參見附錄D.2。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，FAM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團。A.3貓支原體RAA引物序列名稱引物/探針序列(5'→3')擴增片段長度靶基因貓支原體F:AGAAGCACTTGCAGGAGATAACGCTGGATTEF-TuR:AATTCTGTGTGAGGGATAATTGAACCTGP:TGGATTATTACTTCGTGGAGTAAACCGTGAAGA[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TGAACGTGGACAAG-C3注：目的基因序列參見附錄D.3。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，FAM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團。8名稱引物/探針序列(5'→3')擴增片段長度靶基因貓衣原體F:TAGAAATCAATAAAACAGACGGAGGCACApmp9R:ACTAAAGATCCTGCGGATAGGGTAATAGGP:AAACAGACGGAGGCACAAGCTATACGGG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]GATCATCTTTTCAG-C3注：目的基因序列參見附錄D.4。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，FAM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團。名稱引物/探針序列(5'→3')擴增片段長度靶基因貓波氏桿菌F:TAAGTCCGTCGCAAACCTGCCGTAATCC203bpflaAR:CGATTGGGACTTGTTCAGGTTGTTCTGGP:GCTGCCCGGTTTGAAGAAGCCTTTCTC[FAM-dT]C[THF][BHQ1-dT]GGGAGCCTCAACATGG-C3注：目的基因序列參見附錄D.5。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，FAM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團。9C.1貓杯狀病毒實時逆轉錄熒光RT-R試劑體積/μL實時熒光RT-RAA擴增體系（凍干粉）20啟動劑正向引物(10μmol/L)反向引物(10μmol/L)探針(10μmol/L)模板反應總體系25C.2貓皰疹病毒/貓支原體/貓衣原體/貓波氏桿菌實時熒光RAA反試劑體積/μL實時熒光RAA擴增體系（凍干粉）20啟動劑正向引物(10μmol/L)反向引物(10μmol/L)探針(10μmol/L)模板2.0反應總體系25ttggaaaactccgccaaagacaatcgacccaacctcacgtggacaacagctctggaatgcgtgtttgtacgcaagccagcatggtgttgagttttacaataaagttgaagttggcagaaagagctgttgagtacgagggtctccacatcgaacccccaaattactactcagctttggagcattacaacagccagtttaatggtgtggacgcggtccgatcagatcaatttgagtgatgcaaccgcccttcactgtgatgtgttcgaagtttgagcatgtgctcaacctgcgctaacgtgcttaaatattatggggatcActgtccgcatttacatagatggtgcctatggaataggtaagagtttaacggcgaagtacctggtcagagcggatgaaaatcgaccgggatatacttactacttcccagaaccaatgctatactggcgtagtctctttgaaactgatgttgtcggtggtatctatgccgtccaggaccggaaacgacgtggtgaattatcagctgaagagcctatatcaccgcccactatcaagcaagatttgccgcaccataccttcttttacattccagactatccacaataacaggatatcagaaagttgtatgtgaggacccgacgtgaccctaatcatagatagacaccctctcgcctctctggtctgtttcccactcgcaagatattttgtgggtgatatgactcttgggtctgtacttagggcaacacttccacgagaacctcctggtggaaatctagttgtaacaaccttgaatatcgaggaacatttgaagcgtctcaggggacgctcaagaCgttgaccatggtaaaactacattaacagctgctatagctacagttttagctaaaaaaggtttatctgaagctcgtgattatgcttctattgataatgctccaggagcacgtggtattacaattaatacatcacacattgaatatcaaactgaaaaacgtcactatgctcacgttgactgtcctggtcacgctgactatgttaaaaacatgattacaggggcagctcaaatggatggtgctatcttagttgttgctgcaacagatggaccaatgcctcaaacacgtgaacacattcttttatctagacaagttggtgttcgtatcgttgttttcttaaacaaatgtgatatgttagaaggtgaagaagagatgattgaacttgttgaattagaagttcgttcacttctttcagaatacggatttgatggataatgctccaattattcgtggatctgctaaattagctcttgatggtgttcctcaatgagaagaaaaagttatggaattaatggatgcagttgatacatacattgaaactccagaaaaagattttgaaaaaccattcttaatggctgttgaagacgttttcacaattacaggacgtggaactgttgctacttttatgatcctgttgttgttgaaggtacatctgcagagaatctagaaatcaataaaacagacggaggcacaagctatacgggttcgatcatcttttcaggaaggtatgtccctagtactcaagaaataatgaagcatgtttctaaattttcccaacctattaccctatccgcaggatctttagttttagaaaaaggagcccatctagaggctaaatctctaacacaaacggctggatctaaagttatcttagatcaaacatccagtatagaaacaaaagaaaacctagatattaaagagctttggttacgtcttgaggaaaccctacagccacaaaaatttctacagccggcaatgcccatactgttacggtacaaggacctttgggaatctttgctgatcatgaaaccttctatgccaatcacttgctcacaatgtagatcaagaattgctaaaactggtagataaagacatcacaaaaatcacgctcgttgatgttD.5