2第二章基因工程本章學習目的：

學習基因工程基本原理和基本操作過程,為進一步學習生物技術相關知識和從事基因工程工作打下基礎。

2.1基因工程概況

2.1.1基因工程的基本含義

按照人們的愿望（人為的），進行嚴密的設計（類似工程設計），通過體外DNA重組（非生命活動過程）和轉基因等技術，有目的地改造生物種性，使現有的物種在較短的時間內趨于完善（區別于自然突變和常規育種），創造出更符合人們需求的新的生物類型;利用這種技術對人類疾病進行有效的診斷和治療。2.1.2基因工程的主要理論依據不同基因具有相同的遺傳物質(DNA/RNA)基因是可以從DNA上切割下來的基因是可以轉移的多肽與基因之間存在對應關系遺傳密碼是通用的(絕少數除外)可以通過DNA復制把遺傳信息傳遞給下一代

2.1基因工程概況

編碼氨基酸的通用遺傳密碼子第一位（5′端）第二位（中間）第三位（3′端）UCAG

U苯丙氨酸Phe絲氨酸Ser酪氨酸Tyr半胱氨酸CysU苯丙氨酸Phe絲氨酸Ser酪氨酸Tyr半胱氨酸CysC亮氨酸Leu絲氨酸Ser終止stop終止stopA亮氨酸Leu絲氨酸Ser終止stop色氨酸TrpG

C亮氨酸Leu脯氨酸Pro組氨酸His精氨酸ArgU亮氨酸Leu脯氨酸Pro組氨酸His精氨酸ArgC亮氨酸Leu脯氨酸Pro谷氨酰胺Gln精氨酸ArgA亮氨酸Leu脯氨酸Pro谷氨酰胺Gln精氨酸ArgG

A異亮氨酸Ile蘇氨酸Thr天冬酰胺Asn絲氨酸SerU異亮氨酸Ile蘇氨酸Thr天冬酰胺Asn絲氨酸SerC異亮氨酸Ile蘇氨酸Thr賴氨酸Lys精氨酸ArgA甲硫氨酸Met蘇氨酸Thr賴氨酸Lys精氨酸ArgG

G纈氨酸Val丙氨酸Ala天冬氨酸Asp甘氨酸GlyU纈氨酸Val丙氨酸Ala天冬氨酸Asp甘氨酸GlyC纈氨酸Val丙氨酸Ala谷氨酸Glu甘氨酸GlyA纈氨酸Val丙氨酸Ala谷氨酸Glu甘氨酸GlyG

*

UGA在所有生物的線粒體中編碼色氨酸；CUA在酵母線粒體中編碼蘇氨酸；AGA在果蠅中編碼絲氨酸，在哺乳動物線粒體中編碼終止子；AUA在哺乳動物、果蠅和酵母線粒體中編碼蛋氨酸。2.1.3基因工程研究的基本技術路線

2.1基因工程概況

2.1.4基因工程突出的優點

打破了常規育種難以突破的物種之間的界限可以使原核生物與真核生物之間的遺傳信息進行相互重組和

轉移可以使動物與植物之間的遺傳信息進行相互重組和轉移可以使人與其他生物間的遺傳信息進行相互重組和轉移大大縮短了育種年限

2.1基因工程概況

2.2.1DNA

2.2.1.1DNA的組成和結構

DNA由腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成。脫氧核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸基組成。四種脫氧核苷酸的脫氧核糖、磷酸基的結構和位置相同，只是各自的堿基不同。

2.2

DNA重組

2.2.1.1DNA的組成和結構組成：堿基有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4種。脫氧核苷酸之間通過磷酸二酯鍵連接。多個脫氧核苷酸按此方法連接成多聚脫氧核苷酸，其一端為游離的5′-磷酸基(5′-P)稱為5′端；另一端為游離的3′-羥基(3′-OH),稱為3’端。

2.2

DNA重組

2.2.1.1DNA的組成和結構

DNA的雙螺旋結構

DNA兩條脫氧核苷酸鏈總是按照堿基A與T互補配對和G與C互補配對的，通過氫鍵形成穩定的雙螺旋結構，稱為雙鏈DNA。少數病毒和噬菌體中的DNA是以單鏈形式存在的。2.2.1.1DNA的組成和結構堿基的互補配對和書寫方式

2.2

DNA重組

2.2.1.2DNA的功能

（1）DNA分子能在細胞內復制以原有的DNA鏈為模板，從特定的復制起始位點（ori）起始，復制出新的DNA鏈。

（2）DNA是基因的主要攜帶者

一個基因是DNA分子上的一個特定的核苷酸序列。2.2.1.2DNA的功能原核生物基因啟動子相關的保守核苷酸序列Pribnow框或-10區：-4~-13bp之間由６個核苷酸組成，多數是TATAAT序列。-35區：-35bp前后保守的TTGACA序列。動、植物基因啟動子相關的保守核苷酸序列生物類型

TATA區（-25~-30）

CAAT區（-70~-80）

GC區（-80~-100）動物TATAATAGGCCAACTGCCACACCC植物TCTATATA1~3CA或TGTATAAA1~3CACA2~5GNGA2~4CC或TA2~5TNGA2~4TTGGGCGGG2.2.1.2DNA的功能終止子發夾結構序列2.2

DNA重組2.2.2獲得DNA片段的主要途徑目的：（1）獲得含有基因的DNA片段（2）獲得含有基因表達調控因子的DNA片段（3）獲得含有與基因重組有關的核苷酸序列的DNA片段主要途徑：

（1）限制性內切核酸酶酶切法（2）PCR擴增法（3）化學合成法2.2.2獲得DNA片段的主要途徑2.2.2.1限制性內切核酸酶和DNA片段化

限制性內切核酸酶(restrictionendonuclease)

功能：能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列,并在合適的反應條件下,使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開,產生具有3′-OH和5′-P的DNA片段。

命名：HindIII由HaemophilusinfluenzaeRd中屬名的H,種名的in和菌株代號的d組成,III表示從此菌株中提取的第三種限制性內切核酸酶。

識別序列規律：旋轉對稱或左右互補對稱。

切割位點:在識別序列上使磷酸二酯鍵斷開的位置。

粘性末端：產生的DNA片段末端的一條鏈多出一至幾個核苷酸。3′端比5′端長的稱為3′粘性末端，5′端比3′端長的稱為5′粘性末端。平末端：產生的DNA片段末端是平齊的。限制性內切核酸酶識別序列、酶切位點和酶切片段末端2.2.2.1限制性內切核酸酶和DNA片段化

2.2.2.1限制性內切核酸酶和DNA片段化

限制性內切核酸酶的切割方法:單酶切法雙酶切法完全酶切法部分酶切方法2.2.2獲得DNA片段的主要途徑2.2.2.2

特異性DNA片段的PCR擴增特點：擴增特異DNA片段。一個待擴增的DNA片段，在3h內可擴增出約106個這樣的DNA片段。關鍵因子：

※引物

※dNTP※模板DNA

※耐熱性DNA聚合酶2.2.2.2

特異性DNA片段的PCR擴增耐熱性DNA聚合酶普通耐熱DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶和TthDNA聚合酶等）高保真耐熱DNA聚合酶（如PfuDNA聚合酶和VentDNA聚合酶）長片段耐熱DNA聚合酶（如LongTaqDNA聚合酶）熱啟動耐熱DNA聚合酶（如HotstarTaqDNA聚合酶）測序用途的耐熱DNA聚合酶（如BcaBestDNA聚合酶和SacDNA聚合酶）等。2.2.2.2

特異性DNA片段的PCR擴增反應過程：※反應系統加熱至90~95℃,底物雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA；※降溫至37~60℃,使引物與模板DNA鏈互補序列雜交(復性

)；※升溫至70~75℃，耐熱性DNA聚合酶催化引物按5′→3′方向延伸,合成模板DNA鏈的互補鏈(延申)?！貜鸵陨线^程，一般經過25～30次循環片段。2.2.2.2

特異性DNA片段的PCR擴增擴增示意圖2.2.2獲得DNA片段的主要途徑2.2.2.3化學合成目的基因

根據待合成的DNA片段預定的核苷酸序列，采用DNA合成儀，將4種核苷酸單體按3′→5′磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段。DNA合成儀合成引物合成寡核苷酸連桿合成基因片段2.2.3DNA片段的連接2.2.3.1DNA連接酶（DNAligase）催化機理：催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3′-OH末端與5′-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前常用的連接酶：

E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4RNA連接酶熱穩定連接酶2.2.3DNA片段的連接具互補粘性末端片段之間的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接2.2.3DNA片段的連接具平末端DNA片段之間的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行連接2.2.3DNA片段的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接2.2.3DNA片段的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行連接2.2.3DNA片段的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接

DNA片段加連桿后或加銜接頭連接2.2.3DNA片段的連接

2.2.3.3DNA重組類型

插入重組置換重組2.3基因克隆載體基因克隆載體的含義

能夠承載外源基因，并將其帶入受體細胞得以相對穩定維持的DNA分子稱為基因克隆載體（genecloningvector）。基因克隆載體應具備的基本條件具有1個或多個克隆位點。進入受體細胞后，一般是能夠以不同的形式進行復制。含有供選擇克隆子的標記基因?？寺≥d體必須是安全的。2.3基因克隆載體克隆載體種類按構建克隆載體的材料來源分:

質粒克隆載體、病毒（噬菌體）克隆載體、線粒體克隆載體、

人工染色體克隆載體、葉綠體克隆載體......按克隆載體的用途分:

一般克隆載體、表達載體、建庫載體、T或U載體......

按克隆載體的受體生物分:原核生物克隆載體：

大腸桿菌克隆載體、放線菌克隆載體......真核生物克隆載體酵母克隆載體、植物克隆載體、動物克隆載體、

人克隆載體......

2.3基因克隆載體2.3基因克隆載體含義：以質粒DNA分子為基礎構建的克隆載體，必須含有質粒的復制起始位點。種類：

大腸桿菌質粒載體藍藻穿梭質粒載體農桿菌Ti質粒載體酵母2μm質粒載體

......2.3.1質?？寺≥d體質粒DNA2.3.1質?？寺≥d體pBR322簡圖2.3.1質?？寺≥d體2.3.1質粒克隆載體2.3.1質?？寺≥d體2.3.1質?？寺≥d體2.3基因克隆載體含義

以病毒（噬菌體）DNA或cDNA為主構建的克隆載體，或者通過轉染直接進入宿主細胞，或者包裝成病毒顆粒后通過轉導進入宿主細胞。種類

噬菌體克隆載體：

λ噬菌體克隆載體

Cosmid載體

植物病毒克隆載體：CaMV克隆載體

動物病毒克隆載體：痘苗病毒載體腺病毒載體反轉錄病毒克隆載體2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體入噬菌體載體gtwes-λB

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體痘苗病毒載體示意圖2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體（1）含義：指能在宿主細胞中穩定地復制并準確傳遞給子細胞的人工構建的染色體。（2）特點：能容納長達1000kb以上的外源DNA片段。（3）用途：構建基因組文庫,克隆和轉移完整的高分子量基因,基因功能鑒定,基因治療……

2.3基因克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體（4）類型：線形的人工染色體：必須含有端粒、著絲粒和復制起始區。包含：酵母人工染色體（YAC)人類人工染色體（HAC)哺乳動物人工染色體（MAC)環形的人工染色體：不需要端粒和著絲粒，

必須含有合適的復制起始區。包含：細菌人工染色體(BAC)

源于噬菌體Ｐ1的人工染色體(PAC)

雙元細菌人工染色體(BIBAC)

可轉化人工染色體(TAC)2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體2.3基因克隆載體

2.3.4體內同源重組整合載體（系統）2.3.4.1常規基因整合平臺系統

內源平臺雙交換置換載體內源平臺雙交換插入載體內源平臺單交換插入載體外源平臺雙交換插入載體2.3.4.1常規基因整合平臺系統

2.3.4體內同源重組整合載體（系統）2.3.4.2基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統loxP位點序列示意圖2.3.4.2基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統2.4獲得目的基因2.4.1目的基因來源

目的基因：在基因工程設計和操作中，被用于基因重組、改變受體細胞性狀和獲得預期表達產物的基因。

目的基因的生物來源:真核生物染色體基因組原核生物染色體基因組質粒基因組病毒（噬菌體）基因組

線粒體基因組葉綠體基因組

2.4獲得目的基因2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.1利用限制性內切核酸酶酶切法直接分離

目的基因

2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.2利用PCR直接擴增目的基因PCR擴增含目的基因DNA示意2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.3目的基因的化學合成2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.4通過構建基因組文庫或cDNA文庫分離的基因2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.4通過構建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因2.5目的基因導入受體細胞

2.5.1受體細胞

2.5.1.1原核生物

種類：大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌、棒狀桿菌、放線菌等2.5目的基因導入受體細胞

2.5.1.1原核生物

特點：大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的進入;沒有核膜，染色體DNA沒有固定結合的蛋白質，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩;基因組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和質體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析；原核生物多數為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養簡單,繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。2.5.1受體細胞

2.5.1.2真核生物種類：

酵母：基因結構相對比較簡單，便于基因工程操作；

培養簡單，適于大規模發酵生產，成本低廉；基因表達產物能分泌到培養基中,便于產物的提取加工;

不含特異性的病毒，不產生毒素，是安全的受體細胞。植物細胞：具全能性。

有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草和擬南芥等。動物細胞：多采用生殖細胞、受精卵細胞或胚細胞以及干細胞。

有豬、羊、牛、魚、鼠、猴等。2.5.1受體細胞2.5.1.2真核生物特點：真核生物細胞具備真核基因表達調控以及表達產物加工和分泌等的機制，因此作為受體細胞表達真核基因優于原核生物細胞。

真核細胞模式圖2.5目的基因導入受體細胞

2.5.2重組DNA分子導入受體細胞化合物誘導轉化法根癌農桿菌介導轉化法

電穿孔轉化法微彈轟擊(基因槍)轉化法激光微束穿孔轉化法超聲波處理轉化法

脂質體介導轉化法

體內注射轉化法花粉管通道轉化法

精子介導法低能離子束介導轉化法2.5.2.1外源DNA轉化方法2.5.2外源DNA導入受體細胞2.5.2.2病毒(噬菌體)顆粒轉導法

用病毒(噬菌體)的DNA（或cDNA）構建成重組DNA，在體外包裝成重組病毒(噬菌體)顆粒，通過感染使重組DNA進入受體細胞。

方式：重組病毒直接感染受體細胞重組病毒同另一輔助病毒一起感染受體細胞重組病毒感染互補型受體細胞系適用：主要用于基因組文庫或cDNA文庫的構建和動植物的轉基因。2.5.2.2病毒(噬菌體)顆粒轉導法2.5.2外源DNA導入受體細胞2.5.3克隆子的篩選2.5.3.1根據載體標記基因篩選轉化子根據載體抗菌素抗性基因篩選轉化子根據載體除草劑抗性基因篩選轉化子根據LacZ′基因互補顯色篩選轉化子根據生長調節劑非依賴型篩選轉化子根據核苷酸合成代謝相關酶基因缺失互補篩

選轉化子2.5.2外源DNA導入受體細胞2.5.3克隆子的篩選2.5.3.2根據報告基因篩選轉化子β-葡萄糖酸苷酶基因（gus）

螢火蟲熒光素酶基因（luc）綠色熒光蛋白基因（gfp）2.5.3.3根據形成噬菌斑篩選轉化子

2.6重組子的鑒定2.6.1根據重組DNA分子特征鑒定重組子

2.6.1.1根據重組DNA分子大小鑒定重組子2.6.1.2根據重組DNA分子酶切圖譜鑒定重組子2.6.1.3根據PCR擴增片段鑒定重組子2.6.1.4采用DNA分子雜交法鑒定重組子Southern印跡雜交斑點印跡雜交菌落（或噬菌斑）