ICS11.100.10

CCSC30

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

`

分子體外診斷檢驗冷凍組織檢驗前過程的

規(guī)范第3部分：分離DNA

Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Specificationsfor

pre-examinationprocessesforfrozentissue—Part3:IsolatedDNA

(ISO20184-3:2018,IDT)

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件是GB/T42080《分子體外診斷檢驗冷凍組織檢驗前過程的規(guī)范》的第3部分。GB/TXXXXX

已經(jīng)發(fā)布了以下部分：

——第1部分：分離RNA；

——第2部分：分離蛋白質(zhì)。

本文件等同采用ISO20184-3:2018《分子體外診斷檢驗冷凍組織檢驗前過程的規(guī)范第3部分：分

離DNA》。

本文件做了下列最小限度的編輯性改動：

刪除ISO20184-3:2018的前言和引言；

用適用的我國標準化文件替換“規(guī)范性引用文件”中ISO/IEC國際文件；

用適用的我國標準化文件替換“術(shù)語和定義”中的ISO/IEC國際文件；

用適用的我國標準化文件替換“參考文獻”中ISO/IEC國際文件。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。

本文件由國家藥品監(jiān)督管理局提出。

本文件由全國醫(yī)用臨床檢驗實驗室和體外診斷系統(tǒng)標準化技術(shù)委員會（SAC/TC136）歸口。

本文件起草單位：

本文件主要起草人：

II

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

引言

分子體外診斷（包括分子病理學(xué)）使醫(yī)學(xué)取得了重大進展。隨著用于分析人體組織和體液中的核酸、

蛋白質(zhì)和代謝物的新技術(shù)的出現(xiàn)，預(yù)計將取得進一步進展。然而，這些分子的完整性和圖譜在標本采集、

運送、貯存及處理過程中可能發(fā)生變化，因此使得診斷或研究的結(jié)果不可靠或甚至不可能。這是因為在

隨后的檢驗分析中不會考慮患者的實際情況，而是參考在檢驗前生成的人工圖譜。因此需要使從標本采

集到檢驗整個過程標準化。

GB/T42080《分子體外診斷檢驗冷凍組織檢驗前過程的規(guī)范》規(guī)定了冷凍組織的分子體外診斷檢

驗的檢驗前操作步驟的標準化要求，擬由3個部分組成。

第1部分：分離RNA。目的在于規(guī)范化冷凍組織的RNA檢驗的標準化檢驗前操作步驟，減少RNA譜

的變化，保障后續(xù)檢驗結(jié)果的有效性和可靠性。

第2部分：分離蛋白質(zhì)。目的在于規(guī)范化冷凍組織的蛋白質(zhì)檢驗的標準化檢驗前操作步驟，減少蛋

白質(zhì)譜變化和修飾。

第3部分：分離DNA。目的在于規(guī)范化冷凍組織的DNA檢驗的標準化檢驗前操作步驟。

組織中的DNA的完整性在加工和貯存過程中可能發(fā)生變化。DNA分子的修飾能影響檢驗結(jié)果

的有效性和可靠性。有必要采取特殊措施，盡量減少所描述的DNA的變化和修飾，以備后續(xù)檢驗。

因此，需要對從標本采集到DNA檢驗的整個過程進行標準化。已經(jīng)進行了研究，以確定重要

的影響因素。本文件借鑒了這項工作，將冷凍組織在所謂的檢查前階段進行DNA檢驗的步驟編纂

和標準化。

在本文件中，使用了以下助動詞：

-“應(yīng)”表示一項要求；

-“宜”表示一項建議；

-“可”表示許可；

-“能”表示一種可能性或能力。

III

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

分子體外診斷檢驗冷凍組織檢驗前過程的規(guī)范第3部分：分離DNA

1范圍

本文件提供了在進行分子分析之前的檢驗前階段，用于DNA檢驗的冷凍組織標本的處理、記錄、貯

存及取材的要求和建議。

本文件適用于醫(yī)學(xué)實驗室和分子病理實驗室對冷凍組織中提取的蛋白質(zhì)進行的分子體外診斷檢驗，

包含實驗室自建檢測。本文件也適用于實驗室客戶、體外診斷開發(fā)者和制造商、生物樣本庫、開展生物

醫(yī)學(xué)研究的機構(gòu)和商業(yè)組織、以及監(jiān)管機構(gòu)。

本文件不包括冷凍前經(jīng)過化學(xué)穩(wěn)定預(yù)處理的組織。

注：國際、國家或地區(qū)法規(guī)或要求同樣能適用于本文件所涵蓋的特定內(nèi)容。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T22576.1-2018醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的要求第1部分：通用要求（ISO15189:2012，IDT）

3術(shù)語和定義

ISO15189界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。

ISO和IEC維護的用于標準化的術(shù)語數(shù)據(jù)庫，地址如下：

——ISO在線瀏覽平臺：可在/obp上獲得。

——IEC電子百科：可在/上獲得。

3.1

等分樣品aliquot

假定取樣誤差忽略不計時，大量均質(zhì)物質(zhì)的一部分。

注1：該術(shù)語通常適用于液體。組織是異質(zhì)的，所以不能等分。

注2：該定義源于第[22],[23],[24]條參考文獻。

3.2

環(huán)境溫度ambienttemperature

未經(jīng)調(diào)節(jié)的周圍空氣的溫度。

3.3

分析物analyte

4

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

被測量名稱所代表的組分。

[來源：GB/T21415-2008,3.2，有修改]

3.4

分析檢測性能analyticaltestperformance

測量待測分析物的檢驗的準確度、精密度和靈敏度。

注：也能適用于其他試驗性能特性，比如穩(wěn)健性、重復(fù)性等。

3.5

生物樣本庫biobanking

獲取和貯存生物材料以及相關(guān)信息和數(shù)據(jù)的過程，以及與采集、制備、保存、檢測、分析和分發(fā)有

關(guān)的部分或全部活動。

3.6冷缺血coldischemia

組織自人體取出后至穩(wěn)定或固定前的存在狀況。

3.7

診斷diagnosis

從其體征和/或癥狀中識別健康或疾病狀態(tài)，診斷過程能通過各種檢驗對個體狀況進行分類，分成

不同的類別或亞類，以便做出關(guān)于治療和預(yù)后的醫(yī)學(xué)決策。

3.8

DNA

脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid

以雙鏈或單鏈形式存在的脫氧核糖核苷酸聚合體。

[SOURCE:ISO22174:2005,3.1.2]

[來源：SN/T2102.1-2008,3.1.2]

3.9

DNAase

脫氧核糖核酸酶deoxyribonuclease

催化DNA降解成更小組分的酶。

3.10

檢驗examination

分析檢測analyticaltest

以確定一個特性的值或特征為目標的一組操作。

注：從分離的分析物開始、包括各種用于定性或定量檢驗的參數(shù)測試或化學(xué)操作的過程。

[來源：GB/T22576.1-2018，3.7，有修改,刪除原注1~3，補充新注，“分析檢測”被添加為首選術(shù)

語。]

3.11

大體檢查grossing,grossexamination

5

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

為獲得診斷信息，在準備后續(xù)顯微鏡檢查過程中對病理標本所做的肉眼檢查。

3.12

均質(zhì)homogeneous

結(jié)構(gòu)和組成均勻

3.13

干擾物質(zhì)interferingsubstances

能改變檢驗（3.10）結(jié)果的標本（3.18）/樣品（3.17）中的內(nèi)源性物質(zhì)或外源性物質(zhì)（如：穩(wěn)定劑）。

3.14

檢驗前過程pre-examinationprocess

分析前階段preanalyticalphase

分析前工作流程preanalyticalworkflow

按時間順序從臨床醫(yī)生的申請開始，包括檢驗（3.10）申請、病人的準備和身份識別、原始樣品（3.18）

的采集、運送到醫(yī)學(xué)或病理實驗室和在實驗室內(nèi)進行運送、分析物（3.3）的分離并以分析檢驗（3.10）

開始為結(jié)束的過程。

注：檢驗前階段包括影響預(yù)期檢驗（3.10）結(jié)果的準備流程。

[來源：GB/T22576.1-2018，3.15，有修改]

3.15

能力驗證proficiencytest

利用實驗室間比對，按照預(yù)先制定的準則評價參加者的能力。

[來源：GB/T27043-2012,3.7，有修改]

3.16

室溫roomtemperature

本文件中是指18℃-25℃。

[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.19]

注：地方或國家法規(guī)可能存在不同定義。

3.17

樣品sample

取自原始樣品（3.19）的一部分或多部分。

[來源：GB/T22576.1-2018，3.24，有修改]

3.18

原始樣品primarysample

標本specimen

為檢驗（3.10）、研究或分析一種或多種量或特性而取出的認為可代表全部的一獨立部分的體液、

呼出氣、頭發(fā)或組織。

[來源：GB/T22576.1-2018，3.16，有修改]

6

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

3.19

穩(wěn)定性stability

在特定條件下貯存時，樣品（3.17）材料在特定時間內(nèi)保持規(guī)定特性值在特定范圍內(nèi)的能力。

注：本文件涉及的分析物（3.3）是所分離的DNA（3.7）。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.15，有修改]

3.20

貯存storage

在適宜的條件下長時間中斷樣品、分析物或其衍生物（如染色切片或組織塊）的分析前工作流程，

以保持其特性。

注：通常在實驗室檔案庫或生物樣本庫中進行長時間貯存。

3.21

確認validation

通過提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求已得到滿足的認定。

注：“已確認”一詞用于表明相應(yīng)的狀態(tài)。

[來源：GB/T19000-2016，3.8.13，有修改，刪除原注1和注3。]

3.22

驗證verification

通過提供客觀證據(jù)對規(guī)定要求已得到滿足的認定。

注1：“已驗證”一詞用于表明相應(yīng)的狀態(tài)。

注2：認定能包括以下活動

進行替代計算；

將新的設(shè)計規(guī)范與類似的經(jīng)驗證的設(shè)計規(guī)范進行比較；

進行檢測和演示；

在發(fā)布前審查文件。

[來源：GB/T19000-2016，3.8.12，有修改]

3.23

熱缺血warmischemin

失去正常血液供應(yīng)的組織從身體內(nèi)移除前的狀態(tài)。

注：正常血液供應(yīng)的中斷因病例而異。因此，熱缺血持續(xù)時間及其影響取決于個體情況，也能取決于動

脈供血的解剖結(jié)構(gòu)。

[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.25]

3.24

工作流程workflow

完成任務(wù)所需的一系列活動。

[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.26]

7

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

4總則

醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量管理體系的通用要求，特別是關(guān)于標本采集，接收和處理（包括避免交叉污染），

參見GB/T22576.1-2018條款4.2,5.4.4,5.4.6或GB/T27020-2016條款8和7.2。有關(guān)實驗室設(shè)備、試劑和消

耗品的要求應(yīng)遵循GB/T22576.1-2018條款5.3、GB/T22576.1-2018條款和或GB/T

27020-2016條款6.2。

檢驗前、檢驗中和檢驗后（即整個工作流程）的所有步驟都能影響診斷或研究結(jié)果。因此，應(yīng)在開

發(fā)檢驗的過程中驗證和確認整個工作流程。這具體包括所有檢驗前流程，如檢驗要求、患者的準備和鑒

定，主要樣品的采集（運到醫(yī)學(xué)實驗室和在醫(yī)學(xué)實驗室內(nèi)），分析物的貯存和分離。應(yīng)記錄不能完全控

制的工作流程步驟（例如：熱缺血）。

與RNA或蛋白質(zhì)相比，組織中的DNA在熱缺血和冷缺血期間相對穩(wěn)定。對于較長的熱缺血和冷缺血

持續(xù)時間，DNA序列和拷貝數(shù)改變（例如基表基因組雜交（CGH）譜）是未知的【2】。然而，DNA甲

基化譜可能會因缺血而發(fā)生變化【10】。宜盡可能短標本冷凍前的持續(xù)時間，以避免DNA的酶解。應(yīng)記

錄冷凍前的持續(xù)時間，宜記錄冷凍前的溫度【2】。

在DNA檢驗的設(shè)計和開發(fā)過程中，應(yīng)進行風(fēng)險評估(另見ISO14974)。在需要時，應(yīng)制定消除或減少

已識別風(fēng)險的緩解措施，以確保檢驗的執(zhí)行。

關(guān)于標本運送和處理的安全說明應(yīng)符合GB/T22576.1-2018條款5.2.3和5.4.5，以及GB19781。國際、

國家或地區(qū)的法規(guī)或要求也能適用。

在整個檢驗前過程中，應(yīng)采取預(yù)防措施，避免不同標本/樣品之間的交叉污染，例如，在可行的情

況下使用一次性材料，或在處理不同標本/樣品之間進行適當?shù)那鍧嵆绦颉?/p>

如果檢驗制造商對檢驗前步驟有明確的說明，應(yīng)按照這些說明執(zhí)行。當出于正當理由（例如，未滿

足患者需求)，未按照制造商的說明使用商業(yè)產(chǎn)品時，用戶對其確認、驗證、使用和性能負責。

有關(guān)標本采集、運送、接收和處理的一般考慮，請參見ISO20658和ISO20387。

5實驗室外部

5.1標本采集

5.1.1總則

如果已知預(yù)期檢驗，則應(yīng)遵循其使用說明，包括對實驗前步驟的要求，如標本采集（參見條款6）。

另參見GB/T22576.1-2018,5.4.4。

5.1.2患者/標本供者的信息

記錄應(yīng)包括患者/標本供者ID，能用編碼形式。該文件應(yīng)由負責標本采集的部門記錄，并宜包括但

不局限于：

a)患者/標本供者的相關(guān)健康狀況，例如：健康與否、疾病類型、伴隨疾病、人口學(xué)信息（如年齡、

性別等）；

b)組織采集前的常規(guī)醫(yī)學(xué)治療和特殊治療相關(guān)信息，例如麻醉劑、藥物、外科手術(shù)或診斷程序；

c)患者/標本供者的相應(yīng)的知情同意。

5.1.3標本相關(guān)信息

文件記錄應(yīng)包括但不局限于：

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GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

a)如果檢驗需要，通過記錄缺血相關(guān)的血管結(jié)扎/夾閉時間點（通常為動脈夾閉時間）來表示體

內(nèi)缺血開始（熱缺血）；

注：不需要進行小組織切片活檢切除冷凍。

b)組織離體的時間、日期及離體方式（例如：核芯針穿刺、切除及其他活檢裝置采樣）；

c)組織類型、來源和狀況（例如病變組織、未受疾病影響的組織）的描述，包括外科醫(yī)師、放射

醫(yī)師或病理醫(yī)師在手術(shù)室內(nèi)外所做的任何標記；

如果在實驗室外進行組織冷凍，則應(yīng)記錄6.2中描述的步驟，需要進行病理評估時，應(yīng)執(zhí)行6.3。

文件記錄還宜包括標本采集人員身份信息ID，能采用編碼的形式。

5.1.4標本處理

需要冷凍用于診斷目的的組織可能來自大標本，也可能來自小標本（例如通過內(nèi)窺鏡檢查獲取的活

檢標本，或者在需要快速冷凍切片診斷的外科手術(shù)過程中從患者身上取出的標本）。

a)應(yīng)記錄對離體標本所進行的任何添加或變動，例如油墨標記、縫線、切口等標本的方位標

記。

如果標本需要進行病理診斷，則應(yīng)由具有醫(yī)師資格的病理學(xué)家采樣，或者在其監(jiān)督、指導(dǎo)下

進行（參見6.2），這些人員宜了解對標本的所有檢驗，以保證正確處理。

如果在沒有病理診斷要求的情況下取出標本，評估標本的選擇和記錄可由病理學(xué)家以外的其

他有資質(zhì)的人員進行。

b)福爾馬林固定能對基于DNA的檢驗產(chǎn)生負面影響(參見ISO20166-3)。因此，根據(jù)具體的分

析檢驗，首選冷凍組織樣品。如果DNA和RNA都要進行檢驗，請參見1S020184-1。

c)冷缺血能改變DNA（例如甲基化）；因此，只要預(yù)期的檢驗沒有不同的規(guī)定，標本/樣品宜

立即冷凍（參見6.3)。

冷凍能在病理學(xué)家的指導(dǎo)或監(jiān)督下，在實驗室外或在實驗室內(nèi)進行。

如果標本或樣品在實驗室外冷凍，立即進行6.2。

如果標本或樣品在實驗室內(nèi)冷凍，則需要將新鮮的組織標本運送到實驗室。應(yīng)立即執(zhí)行5.2中

描述的新鮮組織運送的步驟。

5.2新鮮組織運送要求

5.2.1總則

如果需要將標本或樣品運送到實驗室進行冷凍，實驗室應(yīng)與臨床或外科部門合作，共同制定有關(guān)標

本運送程序的規(guī)程。

5.2.2運送準備

應(yīng)執(zhí)行以下步驟：

a)選擇和使用容器和包裝（例如冷卻箱、貯存和運輸箱、真空包裝）；

注1：根據(jù)適用的運送規(guī)定。

b)選擇和使用穩(wěn)定程序（例如冷卻方法）進行運送；

注2：意外冷凍新鮮組織（例如以錯誤的方式使用冷包）可能導(dǎo)致組織解凍時DNA降解，還

可能影響形態(tài)特征。

9

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

c)容器的標記（例如注冊號、條形碼、標本類型、數(shù)量和等級、來源的器官組織）和其他文件

[5.1.2,5.1.3,5.1.4和5.2.2a）和b）]。

單個容器可只容納幾個標本，如果這些標本取自同一部位（即相似或相應(yīng)的解剖后者組織器官部

位），并具有相同的大體特征，例如組織類型和疾病狀態(tài)(如炎癥、腫瘤和壞死)。

注3：具有相同大體特征的標本可能具有不同的分子特征。

標本離體后宜立即轉(zhuǎn)移到容器中。然后宜將容器保存在冰上或2℃至8℃，以減少DNA變化（例如碎

裂）。或者，根據(jù)預(yù)期的檢驗要求，在室溫下短時間暴露(例如≤3小時)也能接受。在檢驗的開發(fā)過程

中，應(yīng)規(guī)定并驗證在規(guī)定溫度范國內(nèi)的最長儲存時間。

宜記錄冷缺血期間容器周圍環(huán)境的溫度（例如不同房間的溫度，運送溫度）。如果未測量溫度，則

溫度范圍宜按環(huán)境溫度、室溫或2℃~8℃估算。

5.2.3運送中

宜以合適的方式進行溫度監(jiān)測（例如溫度跟蹤）。如果無法測量溫度，宜估計并記錄運送過程中的

最高溫度【例如環(huán)境溫度，室溫，2℃至8℃或冰（袋）】。

如果標本尚未冷凍，宜立即置于冰上或維持溫度在2℃~8℃情況下進行即時運送，以盡量減少DNA

譜的變化。

應(yīng)記錄與既定運送程序規(guī)程的符合性，并且應(yīng)描述和記錄存在的任何偏離。

6實驗室內(nèi)部

6.1標本接收相關(guān)信息

應(yīng)記錄標本接收人員的姓名（能以編碼形式）、所接收標本的到達日期、時間及狀態(tài)（例如標簽、

包括溫度在內(nèi)的運輸條件、組織類型和標本數(shù)量、容器泄漏/破損）。與既定運輸程序的任何偏離都應(yīng)

記錄（參見5.2）。

應(yīng)核對標本標識的正確性：宜包括標本的臨床信息（例如類型、大小、數(shù)量）（參見5.1.1和5.1.3）、

住院號和/或捐贈者/患者ID、患者姓名、出生日期和組織類型。對于不符合說明書的情況均應(yīng)記錄，例

如標簽、貯存和運送條件（溫度和持續(xù)時間）、標本和泄露/破損的采集容器。

6.2標本病理學(xué)評估和樣品選擇

標本病理學(xué)的評估和記錄以及從標本中選擇用于進一步處理的樣品應(yīng)由具有醫(yī)師資質(zhì)的病理醫(yī)師

完成，或在其監(jiān)督或負責下完成。

當?shù)亍一虻貐^(qū)法規(guī)能適用。

選擇用于DNA檢驗的樣品。

a)用于分子和組織病理學(xué)檢查以及可選的進一步研究目的標本的適當部分的選擇應(yīng)由具有醫(yī)師

資格的病理學(xué)家進行或在其監(jiān)督下進行，以確保采集樣品用于DNA檢查不會影響組織病理學(xué)

分析。

位。宜對組織進行顯微或手工切割以選擇或富集疾病的某些細胞特征。

注1：根據(jù)當?shù)爻绦颍瑯吮镜倪m當部分的選擇也能在實驗室外進行，例如，在手術(shù)室（參見5.1.4）。

在對手術(shù)標本進行大體檢查時，應(yīng)在冷凍前和/或冷凍后檢查標本的正確身份。宜核對標本的

臨床信息（參見5.1.2和5.1.3）（例如類型、大小、數(shù)量），住院號和/或病理學(xué)號和/或供者/

患者ID，患者姓名，患者出生日期和組織類型。手術(shù)標本和所有發(fā)現(xiàn)應(yīng)根據(jù)各醫(yī)學(xué)會的指南

適當描述，并與臨床信息和問題相關(guān)聯(lián)。應(yīng)描述標本的解剖學(xué)定位，必要時可標記切除邊緣

10

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

和其他重要區(qū)域，有助于以后的顯微鏡評估；可拍攝照片。應(yīng)根據(jù)各醫(yī)學(xué)學(xué)會的器官/疾病相

關(guān)指南，獲取有代表性的用于顯微鏡評估的樣品（即大體檢查）。

注2：上述評估或記錄也能在實驗室外進行，例如：在手術(shù)室。

b)當標本從體內(nèi)取出而不需要進行組織病理學(xué)診斷時，該標本的記錄以及樣品的評估、選擇和記

錄可由其他合格人員進行，而不是病理學(xué)家。

c)當需要冷凍切片診斷時，應(yīng)將標本的選定部分冷凍（參見6.3）在適當?shù)睦鋬鼋橘|(zhì)中。應(yīng)記錄使

用的冷凍介質(zhì)。應(yīng)由具有醫(yī)學(xué)資格（委員會認證）的病理學(xué)家對冷凍切片進行評估。

6.3標本或樣品的冷凍

應(yīng)立即冷凍標本或樣品。宜選擇和使用標本或樣品中關(guān)于預(yù)期用途和工作條件的最佳冷凍方法【參

見下面的1）,2）或3）】。

小瓶在預(yù)先冷卻之前應(yīng)貼上標簽。

1)急速冷凍程序(snap-freezingprocedure)[10]：這種方法宜是優(yōu)選，因為它可以最好地保存冷凍組織樣品

中的形態(tài)。異戊烷（C5H12，也稱甲基丁烷或2-甲基丁烷）應(yīng)預(yù)冷，溫度范圍為≤-80℃至＞-160℃，

能用于急速冷凍。能使用液氮（-196℃），干冰（-80℃），-80℃冷凍箱或?qū)Ｓ美鋬鲈O(shè)備進行預(yù)

冷，這些設(shè)備可在控制或不控制冷卻速率的情況下使異戊烷保持在≤-80℃。異戊烷應(yīng)在管子或其

他容器（例如玻璃燒杯）中冷卻，以抵抗大的和突然的溫度變化。預(yù)冷異戊烷的體積應(yīng)至少為標本

或樣品體積的10倍。對于快速冷凍，組織樣品應(yīng)完全浸沒在預(yù)冷卻的異戊烷中。

在組織冷凍后，應(yīng)將其轉(zhuǎn)移到指定的預(yù)冷標記的低溫小瓶中。應(yīng)按照制造商的說明蓋上樣品瓶。當

在用于急速冷凍的裝有異戊烷的試管或容器底部看到沉淀物時，宜更換異戊烷。

異戊烷在室溫和壓力下是極易揮發(fā)且極易燃的液體。因此，實驗室宜通風(fēng)良好。管中的異戊烷宜冷

卻。

2)快速冷凍程序(fast-freezingprocedure)：組織應(yīng)在預(yù)先冷卻的金屬板或置于液氮表面的金屬籃上

或干冰上快速冷凍。金屬表面應(yīng)預(yù)冷，溫度范圍為≤-80℃至＞-196℃。能使用合適的支架和

夾具將金屬板或金屬籃固定到位。或者，樣品能直接在液氮中冷凍，或者在液氮或干冰中的

標記和封閉的貯存瓶中冷凍。然而，緩慢的冷凍過程能導(dǎo)致膜破裂，因為鹽的濃度升高和晶

體形成能嚴重影響形態(tài)。為避免交叉污染，宜在冷凍樣品之間清洗籃子或盤子。

注：在液氮中冷凍的特點是由于其相對較高的溫度，液氮在組織周圍沸騰引起的萊頓弗羅斯特效應(yīng)[11]。這減

少了從樣品到液氮的熱傳導(dǎo)；當將樣品在冷凍前放入標記的小瓶中時，這種情況會變得更糟。

3)快速冷凍切片診斷的組織冷凍程序【另見6.2c)】：組織宜新鮮運送到實驗室，不得延誤。標

本的選定部分應(yīng)放在合適的冷凍介質(zhì)中，冷凍在適合低溫恒溫儀器的專用支撐裝置（例如金

屬網(wǎng)格、底座、圓盤）上。應(yīng)記錄使用的冷凍介質(zhì)。含有組織和冷凍介質(zhì)的支撐裝置宜冷凍

在液氮或干冰中，以保持形態(tài)。切割冷凍切片后，宜將剩余部分從支撐裝置中取出而不解凍，

并貯存在預(yù)冷卻的小瓶中以便長期貯存。

用冷凍培養(yǎng)基處理的樣品宜貯存在-70℃以避免干燥，在使用每種冷凍介質(zhì)處理樣品前宜先評估

DNA的質(zhì)量（參見6.6）。

在冷凍程序之前、期間和之后應(yīng)執(zhí)行以下步驟：

a)冷凍程序的記錄（例如在液氮中冷凍，在液氮或干冰冷卻的異戊烷中快速冷凍，在適當?shù)睦?/p>

凍介質(zhì)中冷凍，以受控制的冷卻速率冷凍）；

b)冷凍時間點和日期的記錄（以確定滯后時間：從身體移除之間的時間段-直到標本或樣品冷

凍）；

11

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c)于低溫貯存的冷凍容器：

1)冷凍容器應(yīng)具有足夠的體積以適應(yīng)保存的標本或樣品的大小；

2)冷凍容器應(yīng)經(jīng)過貯存溫度認證；

3)冷凍容器應(yīng)安全密封，最好用螺帽固定;不得使用帶翻蓋的容器；

注：由于密封不正確，當容器存放在液氮中時，管內(nèi)液氮發(fā)生泄漏時，容器能在標本或樣品回收時爆炸。

d)確定樣品所需的組織尺寸是否適合冷凍前選定的低溫小瓶，因為組織大小決定了容器的大小;

因此，建議標本/樣品在一個維度上不超過1厘米；

e)標簽應(yīng)適合各自的冷凍貯存條件；

注：合適的標簽[例如自粘標簽、手寫、射頻識別（RFID）、預(yù)先標記的容器]應(yīng)通過質(zhì)量驗證。

f)容器的標簽應(yīng)確保標本和樣品的適當可追溯性。因此，容器標簽應(yīng)提供以下最基本信息：

1)標本供者/患者的ID，標本/樣品唯一ID和采集標本和/或樣品的日期，所有這些都能是編

碼形式（每個標本/樣品都是唯一的）；

2)組織類型，組織和疾病狀況影響（例如腫瘤）或未受影響，除非樣品跟蹤系統(tǒng)能將這些

信息與6.3f）1）中使用的標本或樣品的識別信息相匹配；

3)每個容器的唯一編號，能括在6.3f）1）中。

g)標本或樣品的類型，數(shù)量和描述的文件

宜考慮在某些疾病狀態(tài)下（例如腫瘤），分子特征可不均勻地存于組織標本中。因此，由具有資質(zhì)

的病理醫(yī)師對分子檢驗實際使用的組織樣品進行評估是非常重要的。在這種情況下，宜記錄用于分子檢

驗的組織標本所反映的疾病特征（例如：不同的分子機制可能在腫瘤的中心或浸潤前沿被激活，腫瘤也

可能由不同分化等級的區(qū)域組成）。

6.4貯存要求

恒溫應(yīng)≤-70℃。宜用監(jiān)測溫度的系統(tǒng)。

冷凍機或液氮罐應(yīng)具有溫度報警系統(tǒng)。

在取回標本或樣品期間可能發(fā)生嚴重的溫度變化。因此，檢索時間宜盡可能短，以避免樣品解凍。

應(yīng)記錄能使待處理或進一步貯存的標本或樣品解凍的偶然發(fā)生的溫度變化。

宜供備用低溫貯存設(shè)施。

應(yīng)記錄從貯存系統(tǒng)中取出任何標本或樣品的貯存位置、貯存溫度、時間和日期。

6.5DNA的分離

6.5.1總則

應(yīng)根據(jù)國際公認的組織病理學(xué)分類（例如參考文獻[15]）對標本或樣品的細胞組成和疾病狀況進行組

織病理學(xué)診斷（例如在蘇木精/伊紅（H＆E）切片上）。當標本或樣品用于體外分子診斷的時候，在DNA

分離之前應(yīng)根據(jù)檢驗要求確定靶細胞的比例。靶細胞的數(shù)量應(yīng)足以進行檢驗。當標本或樣品不用于分子

體外診斷時，例如用于研究，建議采用類似的方法。

a)所有能接觸樣品或組織載玻片的材料，包括裂解緩沖液和含有該緩沖液的小瓶，用于操作冷

凍樣品進行冷凍切片或轉(zhuǎn)移至裂解緩沖液的小瓶和工具應(yīng)清潔且無核酸酶。在使用前，所有

材料（不包括裂解緩沖液和含有此緩沖液的小瓶）和用于操作冷凍樣品進行冷凍切片并轉(zhuǎn)移

至裂解緩沖液的工具應(yīng)冷卻至＜0℃。處理材料和/或冷凍樣品的人員應(yīng)戴手套。在切割每個冷

凍組織標本/樣品后，應(yīng)根據(jù)制造商的說明用核酸清除劑清潔切片機的相關(guān)部分，包括可重復(fù)

使用的刀片。宜考慮在切片機上使用新的一次性刀片以避免交叉污染；

12

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

b)形態(tài)學(xué)變化（例如腫瘤含量），可能影響檢查結(jié)果；冷凍切片宜用于DNA分離，并通過每隔

50μm切割切片進行蘇木精和伊紅（H&E）染色來檢查形態(tài)學(xué)。

c)應(yīng)記錄所使用的方法以及過程中使用的試劑盒和批號；

提取的DNA宜保存在冰上或2℃至8℃（例如冷凍頭），并宜立即檢測或長期貯存；

為避免DNA檢驗中擴增材料的交叉污染，DNA的分離不宜與檢驗過程的擴增步驟在同一區(qū)域

進行，除非使用封閉系統(tǒng)，以避免交叉-污染。

如果對標本或樣品的正確識別存在疑問，則應(yīng)驗證標本/樣品的身份，例如在人類身份檢測中使用

的方法，如短串聯(lián)重復(fù)（STR）分析。

DNA的分離是診斷工作流程中的關(guān)鍵步驟，在整個工作流程的驗證過程中應(yīng)特別關(guān)注。

宜在DNA能力檢測程序中檢測DNA分離性能。

6.5.2使用商品化試劑盒

當使用專用于從冷凍組織中分離DNA的商品試劑盒時，應(yīng)遵循制造商的使用說明。

6.5.3使用實驗室自建程序

如果在商品化試劑盒的基礎(chǔ)上開發(fā)新的方法具有新的用途，經(jīng)確認符合用戶自定義的用途，應(yīng)制定

說明并遵守。

如果實驗室使用不同于商品試劑盒的自建程序，則應(yīng)確認證明它符合目的，應(yīng)編寫說明并遵守。

使用不同制造商的產(chǎn)品能影響結(jié)果，因為產(chǎn)品不必兼容。只有在組件經(jīng)過配套測試并通過預(yù)期檢驗

驗證時，它們才宜應(yīng)用于診斷測試。

實驗室開發(fā)的冷凍組織切片DNA分離程序宜包含以下步驟：

a)組織切片在裂解緩沖液中重懸。

b)用蛋白酶K消化去除蛋白質(zhì)，并從較大的切片或片段中釋放DNA。對于蛋白酶K消化步驟（例

如在55℃至56℃進行），宜優(yōu)化裂解緩沖液，然后進行蛋白酶K熱滅活步驟，例如在95℃進行。

注:有些商業(yè)試劑盒和實驗室開發(fā)的蛋白酶K方案可用于從同一組織中依次分離RNA和DNA。這種方

案往往會導(dǎo)致一些DNA損失并將DNA帶入到RNA提取過程中，并可能影響從一定量組織中提取的預(yù)期

DNA產(chǎn)量。

c)可選方案：如需要無RNA的基因組DNA，則與RNaseA一起孵育。

注1：當使用實驗室開發(fā)的方法時，過量的RNA可能會與DNA共純化，從而可能干擾預(yù)期的檢驗。

在這種情況下，可能需要加入RNase消化步驟。

注2：即使在消化后，如果消化的RNA片段在DNA純化過程中未被充分去除，共純化的RNA可能會

導(dǎo)致通過分光光度法的DNA產(chǎn)量的過定量。這種過定量和實際存在的RNA也可能干擾檢驗。

d)從裂解液中分離DNA，例如使用苯酚/氯仿法，或者使用適用于從冷凍組織中純化DNA的商業(yè)

試劑盒。

13

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

6.6DNA分離DNA的定性和定量評估

宜根據(jù)診斷試劑盒制造商的說明檢測DNA的數(shù)量和質(zhì)量，或者通過普遍接受的物理、化學(xué)和生物

化學(xué)程序進行檢測。ISO20395為DNA質(zhì)量和數(shù)量測量確認提供了更具體的指導(dǎo)。根據(jù)具體的檢驗，程

序可包括以下一種或多種技術(shù)：

a)通過吸光度測量（A260）、熒光分光光度法或基因組特異性qPCR法進行定量，參見文獻[16]

和[17]

b)通過吸光度測量純度（例如波長掃描，A260/A280比值評估蛋白質(zhì)污染，A260/A230比值來

評估酚、鹽、酒精等污染）；

c)檢測DNA完整性和擴增能力（通過電泳、色譜法或分子方法，例如差異長度擴增子比率）

[18][19]；

d)通過使用外源對照（摻入DNA對照）或檢查異常的qPCR反應(yīng)曲線來檢測干擾物質(zhì)的存在[20]。

注：對于定性檢查，例如存在/缺失、測序、拷貝數(shù)變異，通常采用a)和6.6b)；對于定量檢驗，檢查6.6a）至d）是

必需的。

6.7分離DNA的貯存

應(yīng)按照檢驗制造商的說明貯存分離的DNA。如果沒有這些說明，則應(yīng)按照DNA分離試劑盒制造商

的說明進行操作。

在沒有上述信息的情況下，實驗室應(yīng)使用自建的和經(jīng)過驗證的程序來貯存分離的DNA。

如果所提供的DNA分離試劑盒無法提供信息，或者實驗室使用自建的DNA分離程序，則實驗室應(yīng)建立

和驗證具體的存儲分離的DNA的程序。

為了長期存儲，DNA宜在弱堿性洗脫緩沖液中溶解，例如：TE緩沖液（10mMTris和1mMEDTA，

使用HCL將PH值調(diào)至適合DNA檢驗）。

注：根據(jù)DNA分離程序和所得洗脫液的質(zhì)量，在某些情況下，在室溫下短時間或在2°C至8℃下貯存可能是合適的。

通常長期存儲應(yīng)在-70°C或更低溫度下進行。也能使用其他通過驗證的貯存方法[21][22]。

宜使用適當?shù)拇鎯θ萜鳎缋鋬龉堋?/p>

通常宜避免多次凍融循環(huán)。為了長期存儲，宜將DNA分成小份。任何DNA小份的解凍和重新冷凍

都應(yīng)有記錄。

對于長期貯存，宜有一個經(jīng)過確認的程序來組織和唯一標記含有分離DNA或由其衍生的等分試樣的

貯存容器。

應(yīng)確保可追溯性，例如，通過使用可讀取的RFID，1D或2D條形碼或預(yù)先印制的貯存容器，其具有

適合于低溫貯存的制造商提供的唯一編碼。

14

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

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9

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GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

目次

前言II

...............................................................................................................................................

引言III

..............................................................................................................................................

1范圍4

......................................................................................................................................................

2規(guī)范性引用文件4

....................................................................................................................................

3術(shù)語和定義4

...........................................................................................................................................

4總則8

......................................................................................................................................................

5實驗室外部8

...........................................................................................................................................

6實驗室內(nèi)部10

.........................................................................................................................................

I

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

分子體外診斷檢驗冷凍組織檢驗前過程的規(guī)范第3部分：分離DNA

1范圍

本文件提供了在進行分子分析之前的檢驗前階段，用于DNA檢驗的冷凍組織標本的處理、記錄、貯

存及取材的要求和建議。

本文件適用于醫(yī)學(xué)實驗室和分子病理實驗室對冷凍組織中提取的蛋白質(zhì)進行的分子體外診斷檢驗，

包含實驗室自建檢測。本文件也適用于實驗室客戶、體外診斷開發(fā)者和制造商、生物樣本庫、開展生物

醫(yī)學(xué)研究的機構(gòu)和商業(yè)組織、以及監(jiān)管機構(gòu)。

本文件不包括冷凍前經(jīng)過化學(xué)穩(wěn)定預(yù)處理的組織。

注：國際、國家或地區(qū)法規(guī)或要求同樣能適用于本文件所涵蓋的特定內(nèi)容。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T22576.1-2018醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的要求第1部分：通用要求（ISO15189:2012，IDT）

3術(shù)語和定義

ISO15189界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。

ISO和IEC維護的用于標準化的術(shù)語數(shù)據(jù)庫，地址如下：

——ISO在線瀏覽平臺：可在/obp上獲得。

——IEC電子百科：可在/上獲得。

3.1

等分樣品aliquot

假定取樣誤差忽略不計時，大量均質(zhì)物質(zhì)的一部分。

注1：該術(shù)語通常適用于液體。組織是異質(zhì)的，所以不能等分。

注2：該定義源于第[22],[23],[24]條參考文獻。

3.2

環(huán)境溫度ambienttemperature

未經(jīng)調(diào)節(jié)的周圍空氣的溫度。

3.3

分析物analyte

4

GB/TXXXXX—XXXX/ISO20184-3:2018

被測量名稱所代表的組分。

[來源：GB/T21415-2008,3.2，有修改]

3.4

分析檢測性能analyticaltestperformance

測量待測分析物的檢驗的準確度、精密度和靈敏度。

注：也能適用于其他試驗性能特性，比如穩(wěn)健性、重復(fù)性等。

3.5

生物樣本庫biobanking

獲取和貯存生物材料以及相關(guān)信息和數(shù)據(jù)的過程，以及與采集、制備、保存、檢測、分析和分發(fā)有

關(guān)的部分或全部活動。

3.6冷缺血coldischemia

組織自人體取出后至穩(wěn)定或固定前的存在狀況。

3.7

診斷diagnosis

從其體征和/或癥狀中識別健康或疾病狀態(tài)，診斷過程能通過各種檢驗對個體狀況進行分類，分成

不同的類別或亞類，以便做出關(guān)于治療和預(yù)后的醫(yī)學(xué)決策。

3.8

DNA

脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid

以雙鏈或單鏈形式存在的脫氧核糖核苷酸聚合體。

[SOURCE:ISO22174:2005,3.1.2]

[來源：SN/T2102.1-2008,3.1.2]

3.9

DNAase

脫氧核糖核酸酶deoxyribonuclease

催化DNA降解成更小組分的酶。

3.10

檢驗examination

分析檢測analyticaltest

以確定一個特性的值或特征為目標的一組操作。

注：從分離的分析物開始、包括各種用于定性或定量檢驗的參數(shù)測試或化學(xué)操作的過程。

[來源：GB/T22576.1-2018，3.7，有修改,刪除原注1~3，補充新注，“分析檢測”被添加為首選術(shù)

語。]

3.11

大體檢查grossing,grossexamination

5

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為獲得診斷信息，在準備后續(xù)顯微鏡檢查過程中對病理標本所做的肉眼檢查。

3.12

均質(zhì)homogeneous

結(jié)構(gòu)和組成均勻

3.13

干擾物質(zhì)interferingsubstances

能改變檢驗（3.10）結(jié)果的標本（3.18）/樣品（3.17）中的內(nèi)源性物質(zhì)或外源性物質(zhì)（如：穩(wěn)定劑）。

3.14

檢驗前過程pre-examinationprocess

分析前階段preanalyticalphase

分析前工作流程preanalyticalworkflow

按時間順序從臨床醫(yī)生的申請開始，包括檢驗（3.10）申請、病人的準備和身份識別、原始樣品（3.18