第四章人工染色體載體5/22/20241利用染色體的復制元件來驅動外源DNA片段復制的載體稱為人工染色體載體。人工染色體載體:模擬染色體的復制方式，因此都能裝載大片段的DNA片段。5/22/20242目前常用的人造染色體載體包括：

細菌人工染色體載體（BAC）酵母人工染色體載體（YAC）黏粒載體（cosmid）P1人工染色體載體（PAC）5/22/20243pHC796400bpTcrl

fragmentcosoriAprPstIBamHISalI1978年J.Collins和B.Hohn等人發明構建1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb。第一節黏粒（cosmid）載體5/22/20244第一節黏粒（cosmid）載體

黏粒克隆載體（柯斯質粒載體）實際上是質粒的衍生物，是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成的，其原意是指帶cos位點的質粒。pHC796400bpTcrl

fragmentcosoriAprPstIBamHISalI5/22/20245考斯質粒（cosmid）=質粒+cos序列。

pHC796400bpTcrl

fragmentcosoriAprPstIBamHISalI它是用正常的質粒同λ噬菌體的cos位點構成。

cos序列是l噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。5/22/20246黏粒它的大小一般5-7kb左右，用來克隆大片段DNA。克隆的最大DNA片段可達45kb。①質粒復制起點（colE1）象質粒一樣轉化和增殖。②抗性標記Ampr。③cos位點。有的粘粒載體含有2個cos位點。pHC796400bpTcrl

fragmentcosoriAprPstIBamHISalI一、黏粒的結構特征和用途5/22/20247一、黏粒的結構特征和用途能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞；能像質粒那樣在受體細胞中自主復制；重組操作簡便，篩選容易；裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍；不能體內包裝，不裂解受體細胞。5/22/20248二、構建cosmid克隆載體的策略根據λ噬菌體克隆載體和質粒克隆載體兩者的這些性質，取長去短，設計由質粒和含有cos位點的這種λDNA片段組裝成一類新的克隆載體，即cosmid克隆載體。5/22/20249由λDNA片段和pBR322質粒DNA聯合組成的。cosmid載體----pHC795/22/202410pBR322質粒(p43)5/22/202411用λ噬菌體基因組的cro—rⅡ的BglⅡ限制片段，取代pBR322質粒DNA的位于1459～1666bp之間的Sau3A片段，產生出具有BglⅡ單切割位點的重組體分子。然后通過這個位點，將帶有cos序列、長度為1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入進去，于是得到了pHC79柯斯質粒.5/22/202412λDNA片段除了cos位點之外，在其兩側還具有與噬菌體包裝有關的DNA短序列；

質粒DNA部分則是一個完整的復制子。克隆能力為31～45kb，而且能夠被包裝成為具有感染性能的噬菌體顆粒。5/22/202413三、cosmid克隆載體的特征①構建的cosmid克隆載體是一種環形雙鏈DNA分子，—般在5--7kb。

②cosmid克隆載體具有質粒的性質。包括以下4個方面5/22/202414cosmid克隆載體具有質粒的復制子，在大腸桿菌細胞內按質粒復制的方式進行復制，具有轉化大腸桿菌的功能，并且在氨芐青霉素作用下，同樣也會獲得擴增。cosmid克隆載體通常也具抗菌素抗性基因，作為重組體分子表型選擇標記。其中有一些還帶上基因插入失活的克隆位點。5/22/202415③具有λ噬菌體的特性。在此克隆載體上含有一個cos位點。

cosmid克隆載體在克隆了合適長度的外源DNA，并在體外包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效地轉導對λ噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細胞。5/22/202416

進入寄主細胞之后的cosmid克隆載體DNA分子，便按照λ噬菌體DNA同樣的方式環化起來。但由于cosmid克隆載體并不含有λ噬菌體的全部必要基因，因此它不能通過溶菌周期，無法形成子代噬菌體顆粒。外源片段克隆在黏粒載體中是以大腸桿菌菌落的形式表現出來的，而不是噬菌斑。5/22/202417④構建的cosmid克隆載體較小，因此能承載比較大的外源DNA片段。

如果cosmid克隆載體的大小為6.5kb，按入噬菌體容許包裝的量計算，能承載的外源DNA片段最大可達44.5kb(即51kb～6.5kb)，最小的也有29.9kb(即36.4kb～6.5kb)，所以用這樣的cosmid克隆載體能克隆40kb左右的外源DNA片段。5/22/202418四、cosmid克隆載體的工作原理cosmid克隆載體具有質粒克隆載體的性質，可以按一般質粒克隆載體進行操作，轉化受體細胞，可在受體細胞內進行自行復制。

實際上，使用cosmid克隆載體主要利用它的λ噬菌體克隆載體性質。5/22/202419因為cosmid克隆載體含有cos位點，可承載大的DNA片段，進行體外包裝后能高效率轉導受體細胞。使用cosmid克隆載體的程序與使用λ噬菌體克隆載體的程序有所不同

。5/22/202420作為λ噬菌體克隆載體，線形重組λDNA分子兩端必須各有一個cos末端。而cosmid克隆載體只有一個cos位點，因此必須先對cosmid克隆載體進行適當處理，構成具有兩個cos位點的二聯體線形DNA分子。5/22/202421當外源DNA片段組入二聯體線形DNA分子，并且兩個cos位點之間的DNA核苷酸序列達到足夠長時，兩個cos位點可被A蛋白切割，產生具有兩個cos末端的重組λDNA分子，就能進行有效的體外包裝。5/22/202422使用cosmid克隆載體的基本程序是：

先用一種限制性核酸內切酶切割cosmid克隆載體

具有兩個cos位點的二聯體線形DNA分子

DNA連接酶切割二聯體線形DNA分子和部分切割待克隆的外源DNA片段成為可用于體外包裝的樣品DNA連接酶限制性核酸內切酶5/22/2024235/22/2024245/22/202425

不管是(a)程序還是(b)程序，最后獲得的重組線形DNA分子必須保留質粒的復制起始位點(ori)和選擇標記基因，保證重組的線形DNA分子導入受體細胞后，cos末端自行連接環化，按質粒的性質進行自主復制，并且有效地表達選擇標記基因的產物，供篩選陽性克隆子。5/22/202426五、cosmid克隆載體（自學P72）常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它們大多具有一種或多種限制性內切酶的單一酶切位點。采用這種大容量載體不僅可減少構建基因組DNA文庫的重組克隆數目，減少工作量，提高篩選時的陽性檢出率，而且極其適合高等真核基因的克隆工作。5/22/202427六、構建cosmid文庫應注意哪些問題①載體分子的自身連接，從而導致效率降低或者失敗。

載體自身只相當于可以插入片段的1/10左右，因此往往會出現載體同載體自身連接，結果在一個重組分子內可有幾個柯斯質粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；5/22/202428

②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子。

結果使在基因組內本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結果的分析，后來專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；5/22/202429

③細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費時間。

現雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質粒制成的基因文庫常常不太穩定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。5/22/2024305/22/202431pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。YAC具有自主復制序列、克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標記基因。此外，YAC還具有酵母菌染色體的一些特點。可以接受100-1000kb的外源DNA片段。第二節酵母人工染色體載體5/22/202432pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1這種人工染色體克隆載體實際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質粒克隆載體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質粒復制起始位點(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點、端粒和復制起始位點的序列，以及合適的選擇標記基因。第二節酵母人工染色體載體5/22/202433pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1一、YAC載體的復制元件和標志基因YAC載體應含有下列元件：酵母染色體的端粒序列酵母染色體的復制子酵母染色體的著絲粒序列酵母系統的選擇標記大腸桿菌的復制子標記YAC載體的裝載量為250-400kb5/22/202434這樣的克隆載體在第一受體細胞內可以按質粒復制形式進行高拷貝復制。這種克隆載體在體外與目的DNA片段重組后，轉化第二受體細胞，可在轉化的細胞內按染色體DNA復制的形式進行復制和傳遞。5/22/202435

篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標記；篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補的營養缺陷型。人工染色體克隆載體的特點：能容納長達1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。5/22/202436人工酵母染色體克隆載體的構建YAC(酵母人工染色體)克隆載體是最早構建成功的人工染色體克隆載體。將酵母染色體DNA的端粒(TEL)、DNA復制起點(ARS)和著絲粒(CEN)以及必要的選擇標記(HISA4和TRPl)基因序列克隆到大腸桿菌質粒pBR322中，構建成YCA克隆載體。5/22/202437pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1二、YAC載體的工作原理EcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉化酵母菌重組酵母染色體5/22/202438此克隆載體的sup4(抑制基因：抑制赭色表型)基因上，組裝了供插入外源DNA片段的克隆位。常用的YAC克隆載體有3種：pYAC3、pYAC4和pYAC5。差別：在sup4基因上的克隆位點不同，分別是SnaBI、EcoRI和NotI。（紅色，赤紅色）5/22/202439主要結構：①兩個可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌著絲粒序列(centromere4,CEN4)；③一個自主復制序列(ARS1)；④兩個來自嗜熱四膜蟲(Tetrahymennathermophilp)的末端重復序列(TEL)，以保持重組YAC為線狀結構；YAC載體--pYAC45/22/202440⑤在兩個末端序列中間，有一段填充序列(HIS3)，以便pYAC4在細菌細胞中穩定擴增；⑥Amp抗性及細菌質粒復制原點；⑦一個EcoRⅠ克隆位點，該位點位于酵母菌Sup4tRNA基因內。5/22/202441克隆載體pYAC45/22/202442首先用EcoRI和BamHI雙酶切割，獲得均具BamHI和EcoRI切割末端的兩個DNA片段(雙臂)，隨后把兩端具EcoRI切割末端的外源DNA與此雙臂連接，構成酵母人工染色體。用電激儀把此人工染色體轉化酵母受體細胞。在成功構建pYAC4克隆載體的基礎上，進一步構建了人類人工染色體(HAC)克隆載體和哺乳動物人工染色體(MAC)克隆載體。pYAC4使用程序：5/22/202443Sup4基因編碼赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成為白色)。不含外源DNA片段的pYAC4載體轉化酵母菌，轉化子的菌落呈白色。帶有插入的外源DNA片段的pYAC4重組載體，其Sup4已經失活，結果轉化酵母菌后所產生的轉化子形成赭色菌落。選擇標記--Sup45/22/202444一般酵母表達載體都以大腸桿菌質粒為基本骨架再加上酵母的自主復制序列，選擇標記，外源基因插入位點，啟動子和終止子。

既能在酵母菌中復制也能在大腸桿菌中復制，所謂酵母菌—大腸桿菌穿梭載體。5/22/202445正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel)*酵母自主復制序列（ARS)*酵母著絲點(CEN)*酵母的選擇標記(TRP1、URA1)YAC載體5/22/202446①啟動子和終止子的選擇；②表達盒的穩定性；③外源蛋白的累積部位；④產量的提高。理想的酵母表達系統要考慮5/22/202447釀酒酵母作表達系統的缺點在YAC載體中的插入片段會出現缺失和重排的現象。容易形成嵌合體。即在單個YAC中的插入片段由2個或多個獨立的基因片段連接組成的現象。YAC染色體與宿主細胞的染色體大小相近，YAC染色體轉入酵母細胞后很難從中分離出來。5/22/202448細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質粒的基礎上構建的，其裝載量范圍在50-300kb之間。第三節細菌人工染色體載體（BacterialArtificialChromosomesBAC）5/22/202449一、BAC載體及其結構

BAC載體的大小約7.5

kb，其本質實際上是一個質粒克隆載體。與常規克隆載體的核心區別在于其復制單元的特殊性。BAC復制單元來自F質粒。5/22/202450一、BAC載體及其結構正常細菌人工染色體含有：嚴謹型控制的復制區（oriS)啟動DNA復制的由ATP驅動的解旋酶（RepE)確保3個低拷貝并使質粒精確分配到子代細胞的基因座。（parA、parB

、parC)5/22/202451一、BAC載體及其結構標記基因是氯霉素抗性基因（Cmr)可以通過α-互補原理篩選重組子設計了用于回收克隆DNA的NotI酶切位點。用于克隆DNA片段體外轉錄的SP6和T7啟動子。5/22/202452Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortr