1.2.2微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)知識梳理______聚合酶鏈式反應______（PCR）是一種在體外擴增DNA片段的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用______耐高溫______的DNA聚合酶。1973年，科學家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進而提取出______耐高溫______的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于______聚合酶鏈式反應______（PCR）。一、選擇培養(yǎng)基1.概念：在微生物學中，將允許______特定種類______的微生物生長，同時______抑制______或______阻止______其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。2.類型：（1）利用改變培養(yǎng)條件進行選擇培養(yǎng)。____________70～80℃的高溫______→分離耐高溫的水生棲熱菌。（2）利用添加某種化學物質(zhì)進行選擇培養(yǎng)。加入______青霉素______→分離酵母菌、霉菌等真菌。加______高濃度食鹽______→金黃色葡萄球菌。（3）利用營養(yǎng)缺陷進行選擇培養(yǎng)。不加碳源（含碳有機物）的培養(yǎng)基→分離出______自養(yǎng)型______微生物。______不加氮源______的培養(yǎng)基→分離出固氮菌。3.目的：從眾多的微生物中分離所需要的微生物。4.三種篩選方法的特點及舉例方法特點舉例利用微生物的營養(yǎng)特點進行選擇培養(yǎng)通過控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，使某種微生物能生長，其他微生物不能生長利用只含有尿素一種氮源的培養(yǎng)基，可篩選出分解尿素的細菌利用某種化學物質(zhì)進行的選擇培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中加入某些化學物質(zhì)，利用加入的化學物質(zhì)對微生物產(chǎn)生的影響，抑制某些微生物，同時選擇所需的微生物加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌利用培養(yǎng)條件進行的選擇培養(yǎng)改變微生物的培養(yǎng)條件將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)可以得到耐高溫的微生物5.區(qū)分選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基種類特點用途舉例選擇培養(yǎng)基允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長從眾多微生物中分離所需的微生物加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品，進而產(chǎn)生特定的顏色或其他變化鑒別不同種類的微生物用伊紅—亞甲藍培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌二、微生物的選擇培養(yǎng)如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細菌，還需要對土樣進行適當?shù)奶幚硪约翱茖W的測定微生物數(shù)量的方法——____________稀釋涂布平板______法。1.稀釋涂布平板法將菌液進行一系列______梯度稀釋______，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到______瓊脂固體______培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。由于土壤細菌的數(shù)量龐大，要想得到特定微生物的純培養(yǎng)物，必須要對土壤進行______充分稀釋______，然后再將菌液______涂布______到制備好的______選擇培養(yǎng)基______上；基本操作：（1）______梯度稀釋______；（2）______涂布平板______。①系列稀釋操作：該操作常用在將細胞接種到培養(yǎng)基之前，通過液體稀釋的方法分散細胞，隨著稀釋程度的增大，單位體積中的微生物細胞數(shù)量減少，細胞得以分散。操作步驟：②涂布平板操作步驟2.實驗操作流程①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將_____涂布器_____浸在盛有_____酒精_____的燒杯中。⑤將_____涂布器_____放在火焰上灼燒，待_____酒精_____燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可_____轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿_____，使涂布均勻，待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板_____倒置_____，放入30～37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d，在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的_____單菌落_____。注意事項：①10g土樣加入盛有90mL無菌水中后，已_____稀釋10倍_____，在計算時，不要忽略；②由于使用的是_____選擇_____培養(yǎng)基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因為有些微生物可以利用目的菌的代謝產(chǎn)物來生長繁殖，所以還需要進一步驗證；③過程中所有操作都應在_____酒精燈火焰_____旁進行；④將涂布器從_____酒精_____中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。三、微生物的數(shù)量測定常用方法：稀釋涂布平板法、顯微鏡直接計數(shù)法1.間接計數(shù)法——_____稀釋涂布平板_____法（1）原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的_____一個活菌__________。通過統(tǒng)計平板上的_____菌落數(shù)_____，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。（2）計數(shù)原則①一般選擇菌落數(shù)為_____30～300_____的平板計數(shù)。②在同一稀釋度下，應至少對___3__個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值。③適當?shù)腳____稀釋度_____、_____涂布_____是否均勻是成功統(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。（3）結(jié)果分析：①統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目_____少_____；②統(tǒng)計結(jié)果一般用_____菌落數(shù)_____而不是用活菌數(shù)來表示。原因：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是_____一個菌落_____。（4）計算公式：每g樣品中的菌落數(shù)＝（C÷V）×MC代表某一稀釋度下平板上生長的_____平均菌落數(shù)_____；V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（mL）；M代表_____稀釋倍數(shù)_____。2.直接計數(shù)法——_____顯微鏡直接_____計數(shù)（1）原理：利用特定的_____細菌_____計數(shù)板或_____血細胞_____計數(shù)板在顯微鏡下觀察、計數(shù)，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量。_____細菌_____計數(shù)板可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數(shù)，_____血細胞_____計數(shù)板常用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的觀察和計數(shù)。（2）缺點：①統(tǒng)計的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和，不能區(qū)分死菌與活菌。②個體___小__的細菌在顯微鏡下難以觀察。微生物生長量的測定有計數(shù)法、重量法、生理指標法等方法，但是一般使用計數(shù)法，計數(shù)法可分為直接計數(shù)法和間接計數(shù)法。二者的比較如下表所示：項目直接計數(shù)法間接計數(shù)法原理利用特定細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌主要用具顯微鏡、細菌計數(shù)板培養(yǎng)基計數(shù)數(shù)據(jù)菌體本身培養(yǎng)基上菌落數(shù)優(yōu)點計數(shù)方便、操作簡單計數(shù)的是活菌缺點死菌、活菌都計算在內(nèi)操作較復雜，有一定誤差計算公式每毫升原液含菌數(shù)＝每小格平均菌體數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)每毫升原液含菌數(shù)＝培養(yǎng)基上平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)÷涂布液體積【探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)】1.原理：分解尿素的細菌合成的_____脲酶_____將尿素分解為_____氨_____，使培養(yǎng)基的堿性_____增強_____。2.方法：在以_____尿素_____為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入_____酚紅_____指示劑，培養(yǎng)某種細菌，若指示劑變_____紅_____，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。3.實驗流程（1）土壤取樣：土壤中的細菌絕大部分分布在距地表_____3-8cm_____的土壤層（酸堿度接近中性）。（2）樣品的稀釋：為保證獲得菌落數(shù)為_____30～300_____的平板進行計數(shù)，可將細菌稀釋倍數(shù)為1×103～1×107的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)。（3）微生物的培養(yǎng)與觀察：不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌一般在_____30～37_℃_____的溫度下培養(yǎng)1～2d。在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取_____菌落數(shù)目穩(wěn)定_____時的記錄作為結(jié)果。（4）觀察記錄比較基礎(chǔ)培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，并做好記錄。（5）細菌計數(shù)當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。【拓展——分解尿素細菌的進一步鑒定】1.原理：細菌合成的脲酶將尿素分解為_____氨_____，_____氨_____會使培養(yǎng)基的堿性_____增強_____，pH_____升高_____，因此可以通過檢測培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)生了該化學反應，進而判斷該菌是否為尿素分解細菌。2.方法：在以_____尿素_____為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅：（1）液體培養(yǎng)基可以直接看液體的變色情況；（2）固體培養(yǎng)基上可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)_____紅色環(huán)帶_____，_____紅色環(huán)帶_____直徑與菌落直徑比值越_____大_____，說明分解能力越_____強_____。兩種純培養(yǎng)方法的比較：比較項目平板劃線法稀釋涂布平板法關(guān)鍵操作接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線①一系列的_____梯度稀釋_____②涂布平板操作注意事項_____每次劃線前