1第一章、植物病原真菌的別離、培養(yǎng)及純化技術(shù)21〕材料：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml1、馬鈴薯葡萄糖瓊脂〔PDA〕培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂：potatodextroseagar,簡稱PDA；馬鈴薯蔗糖瓊脂：potatosucroseagar,簡稱PSA。一、真菌學(xué)研究中常見的培養(yǎng)基的制作和滅菌342〕制作步驟馬鈴薯洗凈，去皮稱200g切塊/條，1000ml水煮沸30min，用雙層紗布濾去薯塊，參加15-20g瓊脂，加熱熔化，再加20g葡萄糖，待完全溶解后，趁熱用雙層紗布再過濾，補(bǔ)水并定容到1000ml,分裝于三角瓶或試管中，塞好棉塞并包上牛皮紙，扎緊后高壓滅菌。5自然pH；調(diào)pH值，也可用1mol/L的NaOH或HCl調(diào)至pH為5.5～6.5之間，最后加水補(bǔ)足至1000mL。Tips:實(shí)驗(yàn)中使用的水，一般情況下并不要求用蒸餾水，只要水比較潔凈，沒有有害物質(zhì)就可以了，硬水〔井水〕含有較多的鈣鎂離子，配制的培養(yǎng)基沉淀較多，最好防止使用。62、植物組織和煎汁

許多植物材料如豆莢、莖稈、種子等，可以放在試管中，加少量水份以保持濕潤，滅菌后即能做培養(yǎng)基使用。

植物煎汁是很好的培養(yǎng)基，可以滿足普通微生物的營養(yǎng)需要，各種植物的煎汁都可用作培養(yǎng)液，如加瓊脂即能制成固體培養(yǎng)基。當(dāng)然，必須滅菌后才能使用。73、培養(yǎng)基的分裝根據(jù)不同需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶中。試管分裝時，使用玻璃漏斗。裝入量視試管大小及用途而定，固體培養(yǎng)基的分裝量為管高的1/5左右，用三角瓶分裝培養(yǎng)基時，容量不宜超過容積的1/3----1/2。注意：不要將培養(yǎng)基沾到管口或瓶口上，以免沾濕棉塞而引起污染。8制備好的培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌，方能使用。4、滅菌高壓蒸汽滅菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持續(xù)15-30min，培養(yǎng)基及其它一些用品可用此法滅菌。別離培養(yǎng)時需要的培養(yǎng)皿等，要事先洗凈、晾干/烘干、包裝好，進(jìn)行干熱滅菌。滅菌方法：高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌、過濾滅菌化學(xué)滅菌、以及輻射滅菌等。9

濾膜孔徑主要有0.22μm和0.45μm兩種。過濾太快，濾液中將混入細(xì)菌而使除菌不完全。10115、斜面、平板培養(yǎng)基的制作試管培養(yǎng)基滅菌后，要趁熱斜放。先在桌上放一長木板條，然后逐個擺放，使培養(yǎng)基斜面長度為試管長度的2/5至3/5，冷凝后即成斜面培養(yǎng)基。三角瓶中的培養(yǎng)基可趁熱倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，制作平板培養(yǎng)基。方法是：將培養(yǎng)基冷卻至45～50℃〔低于45℃易凝固，應(yīng)在水浴鍋中加熱融化〕，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌將三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼燒瓶口片刻，在酒精火焰旁將培養(yǎng)皿翻開一小縫，使瓶口正好伸入，傾入培養(yǎng)基約15mL，平置、凝固即成。注意：操作者事先必須洗凈手，并用70%酒精消毒。12二、真菌別離植物病原菌的別離培養(yǎng)，是植物病理實(shí)驗(yàn)室工作中的根本技能。13真菌的別離---就是將所需要的真菌與其它雜菌分開，供給適當(dāng)?shù)臈l件，使它們繁殖而得到純培養(yǎng)。一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧氣等條件要求不同，而供給它們適宜的生活條件，即讓病原菌生活在適宜的培養(yǎng)基上，或參加某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而得到純菌株。14觀察一種真菌病害的標(biāo)本，不一定都能檢查到子實(shí)體而作出診斷。同時，在病部外表或組織中檢查到的真菌，有時也不能斷定就是它的病原物，也有可能是植物組織死亡后在上面生長的腐生性真菌。因此，對有些病害病原物確實(shí)定，最好是經(jīng)過別離和培養(yǎng)工作，且在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下進(jìn)行接種試驗(yàn)，確定它的致病性。此外，為了進(jìn)一步研究真菌的形態(tài)、生活史、生理和生態(tài)，或者用于發(fā)酵如生產(chǎn)抗菌素等，別離而獲得真菌的純培養(yǎng)物是必要的。〔一〕目的意義15別離和培養(yǎng)應(yīng)該在無菌至少很清潔的條件下進(jìn)行。〔二〕、真菌別離的程序1．別離前的準(zhǔn)備工作161.1清潔環(huán)境：別離工作嚴(yán)格說應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，無菌室或無菌箱是別離不可缺少的設(shè)施。為了保證無菌操作，應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：1.2假設(shè)限于條件實(shí)驗(yàn)只能在普通房間進(jìn)行時，必須對房間進(jìn)行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。地上多灑些水，以消除室內(nèi)塵埃，工作臺上鋪好濕毛巾，點(diǎn)燃酒精燈。171.3別離工作開始前最好將所需的一切用品都準(zhǔn)備好，放在超凈工作臺內(nèi)或伸手可及的臺外，以防止操作過程中頻繁走動，破壞環(huán)境帶來雜菌；1.4保證工作人員自身的潔凈，工作前用肥皂洗手；1.5無菌操作前還要用70％酒精擦手；1.6工作中，特別在進(jìn)行無菌操作時，呼吸要輕，不要說話等。18別離材料的選擇對別離培養(yǎng)的成敗有著決定的影響。病害材料應(yīng)盡可能新鮮，如可選擇新近發(fā)病的植株、器官或組織作為別離的材料，可以減少腐生菌的污染。最好在病、健交接處選材取樣。病、健交接處，除材料新鮮，污染的可能性小外，病原菌的生活力強(qiáng)、比較活潑，容易別離成功。2．別離材料的選擇19例如：果實(shí)的腐爛病，就應(yīng)該從剛開始腐爛的局部別離。根腐病和枯萎病也是如此，應(yīng)該盡可能從病株離土需較遠(yuǎn)的局部別離。值得注意的是有些有暈圈的斑點(diǎn)病〔如野火病〕，病菌局限在斑點(diǎn)中央的壞死組織中，從病斑的邊緣是別離不到病菌的。當(dāng)然，這類病害是比較少的。從受害的邊緣局部別離這一原那么，對于絕大局部病害都是適用的。20

采得的材料如已經(jīng)敗壞而沾染大量的腐生菌，有時可以采用接種后再別離的方法，即將沾染有腐生菌的病組織作為接種材料，直接接種在健全的植物組織工植株上，等發(fā)病后再從病株或病組織別離。先接種再別離的方法，用得較多的是植物病原細(xì)菌的別離。

引起果實(shí)和蔬菜腐爛病的真菌，如腐霉屬(Pythium)和疫霉屬(Phytophthora)的真菌，用這種方法別離的效果也很好。別離煙草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用這種方法效果也很好，將煙草種子播在培養(yǎng)皿中的吸水紙上，然后用田間采得的煙草病根切成小塊，撒在種間，幼苗染病后移到胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基平板上，病菌即生長而得到純培養(yǎng)。21

〔1〕酒精用酒精〔70%〕消毒，只浸很短的時間〔幾秒鐘到1分鐘〕，然后用滅菌水沖洗；較大的材料往往是在酒精中浸過后，或用棉花塞蘸酒精涂在組織外表，然后都在火焰上將酒精燒去。3．組織的外表消毒劑22配方為：升汞1g，

濃鹽酸

2.5mL，

加水 至

1000mL。將升汞溶于濃鹽酸中，待其充分溶解后，用水稀釋。升汞劇毒、無色，為便于認(rèn)識，可在溶液中加幾滴紅染料。消毒時間因材料質(zhì)地、發(fā)病部位深淺及污染情況而異，一般3～5分鐘。消毒后用無菌水沖洗3～4次。〔2〕升汞溶液〔0.1%〕23〔3〕次氯酸鈉NaClO3由于漂白粉的成分不固定而影響其消毒效果，目前多改用次氯酸鈉.消毒所用的濃度一般是3%-5%的水溶液，消毒時間5-15分鐘。幼嫩的病組織，外表用藥劑消毒時可能會同時殺死其中的病原真菌，消毒時間應(yīng)盡量縮短。比較平安的方法是不用藥劑消毒，而以滅菌水洗8、9次。244．常規(guī)別離方法植物病原真菌的別離方法主要有兩種：組織別離法和稀釋別離法。組織別離法是最常用的方法.稀釋別離法主要用于病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原真菌的別離。25植物病原真菌的別離一般都是用組織別離法。就是切取小塊病健組織，經(jīng)外表消毒和滅菌水洗過以后，移殖在瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。切取組織的大小要適宜，一般可將較大的組織，在消毒液中消毒后切取中央局部，經(jīng)滅菌水洗過以后培養(yǎng)。4.1組織別離法261〕選取典型的病組織，在病健交界處將其剪成5mm×5mm的小方塊假設(shè)干，裝于火焰滅菌的小碟中。注:選擇新患病的組織作為別離的材料，可以減少腐生菌混入的時機(jī)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的局部滋生，因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健全組織的局部別離。植物病原真菌的組織別離的技術(shù)與步驟：272〕向裝有病組織的小碟中參加70%酒精〔約半碟〕進(jìn)行外表消毒，十幾秒后倒掉酒精。注:先用70％的酒精浸2、3s是為了消除寄主外表的氣泡，減少外表張力，70％的酒精亦用于外表消毒，處理的時間較短(一般數(shù)秒至lmin)。283〕向小碟中參加0.1%升汞或10%次氯酸鈉溶液〔約半碟〕進(jìn)行外表消毒，處理時間可自30秒至3分鐘不等，然后倒掉廢液。注：升汞溶液消毒的時間因材料而異，可自30s至30min不等，如植物組織柔嫩，那么外表消毒時間宜短；反之那么可長些一般情況下，需時間3、5min。294〕向小碟中加滅菌水，沖洗3-4次〔除去殘留的消毒劑〕，將病組織轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙上吸去多余的水〔以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染〕。305〕將吸干水分的病組織移到預(yù)先倒好的PDA平板上，注意要用鑷子輕壓組織使其著靠在培養(yǎng)基上。316〕每皿5塊，均勻擺放，倒置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-5天后檢查結(jié)果。寫明日期、姓名等。32各種真菌病害發(fā)生的部位和病癥不同，其別離要根據(jù)具體情況，采用不同的方法，下面介紹幾種典型材料的別離法。4.1.1斑點(diǎn)病病原真菌的別離4.1.2維管束組織內(nèi)病原真菌的別離4.1.3根腐病菌的別離4.1.4肉質(zhì)組織中病菌的別離4.1.5種子內(nèi)病菌的別離法334.1.1斑點(diǎn)病病原真菌的別離

從病斑切取每邊約3-5mm的小塊病組織，用70%的酒精浸幾秒鐘，再在0.1%的酸性升汞水溶液中浸3-5分鐘；而后用滅菌水換洗3次，將其移置在瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。344.1.2維管束組織內(nèi)病原真菌的別離35從根莖維管束組織別離病菌，可先將寄主病部外表用70％酒精擦拭消毒，將表皮組織用滅菌的解剖刀削去，然后切取其中小塊變色的維管束組織，用升汞或漂白粉液消毒后，用滅菌水沖洗幾次，移置培養(yǎng)基面上。364.1.3根腐病菌的別離根腐或基腐病菌的別離，由材料的大小決定。材料小的可以仿照斑點(diǎn)病的別離法。材料大的那么可采用維管束組織內(nèi)病原真菌的別離法。374.1.4肉質(zhì)組織中病菌的別離多肉的莖、根和果實(shí)等，可以采用維管束組織內(nèi)病菌的別離法，除去外表組織，切到其中小塊病組織別離。如有雜菌感染可采用“直接接種”法，待出現(xiàn)病癥后，用此法再行別離。3839種子如在未破裂的果莢內(nèi)，可以不經(jīng)過外表消毒，在無菌的條件下取出移在培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。4.1.5種子內(nèi)病菌的別離法將整粒的種子或種子的一局部進(jìn)行外表消毒〔升汞或漂白粉〕，用滅菌水洗滌后移在瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。40稀釋法是微生物學(xué)上最早使用的別離法，主要用于別離細(xì)菌和酵母菌等。4.2稀釋別離法植物病原真菌的別離一般很少用稀釋法別離，但有些產(chǎn)生大量孢子的病原真菌和霉菌，可以配成孢子懸浮液稀釋別離。41方法：用無菌水從發(fā)病組織外表沖下孢子，配成孢子懸浮液，用無菌移液管或滴管吸取一定體積的菌液至平板培養(yǎng)基上，然后用無菌玻璃棒將菌液輕輕的均勻涂布在整個平板上，或?qū)⒕阂浦翢o菌培養(yǎng)皿中，然后傾入融化后冷卻至45℃的培養(yǎng)基，輕輕振蕩、平置、凝固后倒置培養(yǎng)。424.2.1孢子別離法產(chǎn)生大量孢子的病菌如青霉屬(Penicillium)、交鏈孢屬(Alternaria)、小叢殼屬(Glomerella)、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)及莖點(diǎn)屬(Phoma)等，那么可配制成孢子懸浮液,以稀釋法或劃線法別離。43

許多真菌的孢子在成熟時有彈射的作用，這樣就可以將產(chǎn)生孢子的材料，放在瓊脂培養(yǎng)基平板的下面或者懸掛在上面，便孢子彈射在培養(yǎng)基上而得到純培養(yǎng)。44典型的是擔(dān)子菌亞門大型真菌擔(dān)孢子的別離和獲得：擔(dān)孢子無色或有色，淺色的擔(dān)孢子需要成團(tuán)堆積時方能辨識，一般是依靠“孢子印”。45為了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，從有病的土壤中別離它們是必要的。別離方法是將土壤取出少許，配制成懸浮液，然后用稀釋法或劃線法別離。4.2.2土壤帶菌別離法

46稀釋倒平板法示意圖47稀釋涂布法示意圖481.dilutesample1ml9ml1010010001041051061072.plateout0.1ml平板稀釋法49圖平板劃線別離法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法50平板劃線方法示意圖51別離真菌時經(jīng)常有細(xì)菌污染。將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至酸性反響，如在10ml培養(yǎng)基中加1-2滴25%的乳酸，可使大局部細(xì)菌受到抑制，而并不影響真菌的生長。4.3細(xì)菌污染的排除52培養(yǎng)基中加適當(dāng)?shù)目咕厥且种萍?xì)菌生長很有效的方法。加金霉素(30ug/ml)可抑制多數(shù)細(xì)菌的生長，加青霉素(20ug/ml)可抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長，加多粘霉素B(5.0ug/ml)可抑制G—陰性細(xì)菌的生長，加鏈霉素(40ug/ml)或氯霉素(50ug/ml)可以抑制大局部細(xì)菌的生長。除去氯霉素可在滅菌前參加外，其他抗菌素都應(yīng)在培養(yǎng)基滅菌后并冷卻到45℃左右時參加(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)。535、內(nèi)生真菌的別離先將健康組織，如：葉片和莖，用自來水沖洗干凈、晾干水分后,剪成約1.5cm×1.5cm的小片(葉)或1.5cm長的小段(莖)。按以下程序進(jìn)行外表消毒:70%酒精漂洗30s→0.1%升汞漂洗1min→70%酒精漂洗30s→無菌水沖洗4次，在無菌濾紙上吸干水分。將上述處理過的材料在無菌狀態(tài)下剪切成0.5cm×0.5cm小片〔剪去0.5cm的邊緣〕，或0.3~0.5cm長段移植于含鏈霉素的供試培養(yǎng)基上〔PDA、Czapek、煎汁培養(yǎng)基〕,于26±1℃黑暗條件下培養(yǎng)，待組織塊邊緣有菌絲長出后，及時挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)入PDA平板上培養(yǎng)。54

用絲瓜誘發(fā)瓜果腐霉：Pythiumaphanidennatum6、土壤真菌的誘發(fā)技術(shù)與步驟：

E、進(jìn)一步純化，保存?zhèn)溆谩、在25℃下放置4-5天后，瓜上長出大量白色棉絮狀的菌絲體，即為所需真菌。C、將絲瓜切段，切口端插入土中。B、參加少量自來水，將菜園土混合成糊狀。A、將菜園土裝于玻璃杯中〔約半杯〕551〕先用剪刀將每粒大麻籽一分為二，然后在水中煮沸，進(jìn)行簡單滅菌。7、水生真菌的誘發(fā)技術(shù)與步驟：4〕進(jìn)一步純化，保存?zhèn)溆谩?〕2天后開始換水，即將培養(yǎng)皿中的混合水全部倒掉，再參加約15ml滅菌水，以后每天換滅菌水一次，一般4-5天后即可從大麻籽上長出菌落，通常為Saprolegniaspp.或Achlyaspp.。2〕每人取3個滅菌培養(yǎng)皿，在每一培養(yǎng)皿中參加3-4瓣經(jīng)簡單滅菌的大麻籽，然后分別參加14、12、10ml滅菌水，再分別參加1、3、5ml池塘水，置25℃培養(yǎng)。56別離工作有時不很順利，失敗的原因很多，以下幾點(diǎn)值得首先加以考慮：〔1〕材料是否新鮮，標(biāo)本中的病菌是否存活，其中雜菌滋生的情況；〔2〕外表消毒所用的藥劑和處理方法是否適宜；〔3〕培養(yǎng)基是否適當(dāng)，包括它的化學(xué)性狀和物理性狀；〔4〕培養(yǎng)的條件是否適宜，受低溫、高溫和其他因子的影響；〔5〕病原生物的生物學(xué)特點(diǎn)，它對于腐生條件的適應(yīng)能力

〔三〕別離結(jié)果與分析：57三、培養(yǎng)culture病原物的培養(yǎng)，即將別離的病原菌移到可以讓這種病原菌正常生長的營養(yǎng)基質(zhì)即培養(yǎng)基上，從而獲得其純培養(yǎng)。58每皿組織塊均勻擺放，干水，輕壓；培養(yǎng)皿倒置或正放；于25℃-27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；黑暗或光照，或光暗交替；日光燈，紫色光，黑光燈等；2-3天后檢查結(jié)果；寫明日期、姓名等。591．菌落的質(zhì)地；2．菌落是凸