目錄16425_WPSOffice_Level1摘要 125306_WPSOffice_Level1Abstract 216508_WPSOffice_Level1第一章緒論 325306_WPSOffice_Level21.1銀納米粒子 325306_WPSOffice_Level31.1.1銀納米粒子的應用 316508_WPSOffice_Level31.1.2銀納米粒子的抗菌作用 525008_WPSOffice_Level31.1.3銀納米粒子的合成方法 716508_WPSOffice_Level21.2課題的提出 1015607_WPSOffice_Level31.2.1研究的目的及意義 1026345_WPSOffice_Level31.2.2研究內容和實驗方法 1125008_WPSOffice_Level1第二章殼聚糖還原制備銀納米粒子合成表征及性質測試 1225008_WPSOffice_Level22.1引言 1215607_WPSOffice_Level22.2材料與試劑 1226345_WPSOffice_Level22.3實驗儀器 133184_WPSOffice_Level22.4銀納米粒子的合成 1428081_WPSOffice_Level22.5適合銀納米粒子的選擇實驗 1424736_WPSOffice_Level22.6銀納米粒子粒度表征 1424370_WPSOffice_Level22.7銀納米粒子的抑菌實驗 1419212_WPSOffice_Level22.8銀納米粒子對于細胞毒性的測試 1518363_WPSOffice_Level22.9不同濃度的銀納米粒子結合溶菌酶后的抑菌實驗 1515607_WPSOffice_Level1第三章結果與討論 1727687_WPSOffice_Level23.1銀納米粒子的紫外-可見吸收性質 1724042_WPSOffice_Level23.2銀納米粒子的形貌 188255_WPSOffice_Level23.3銀納米粒子的抑菌性質 1913393_WPSOffice_Level23.4銀納米粒子的細胞毒性 2116666_WPSOffice_Level23.5銀納米粒子結合溶菌酶的抑菌作用 2226345_WPSOffice_Level1第四章結論與展望 2528982_WPSOffice_Level24.1結論 252348_WPSOffice_Level24.2展望 253184_WPSOffice_Level1參考文獻 2625576_WPSOffice_Level1致謝 29抗菌性銀納米粒子-殼聚糖-溶菌酶復合物的設計摘要銀納米粒子被廣泛使用于很多領域，尤其是在抗菌領域。本論文研究了銀納米粒子與溶菌酶相結合的抗菌活性。在本實驗中，首先制備了不同粒徑的銀納米粒子。我們測試了不同粒徑的銀納米粒子的紫外-可見吸收光譜；隨后通過透射電子顯微鏡（TEM）和動態光散射儀（DLS）測量不同粒徑的銀納米粒子表面形貌特征和粒徑尺寸分布；我們將不同濃度的銀納米粒子與大腸桿菌（MG-1655）混合后涂布在瓊脂板上，培養一段時間后觀察板上的菌落數目以判斷銀納米粒子的抗菌活性與濃度的相關關系。為了測量銀納米粒子的細胞毒性，我們使用CCK-8試劑檢測了銀納米粒子對細胞活性的影響。最后，我們將溶菌酶和不同濃度的銀納米粒子結合起來，利用涂板法研究兩種殺菌物質結合之后的殺菌效果。結果表明，銀納米粒子的抗菌活性和細胞毒性隨著濃度的增加而增大。同時結合溶菌酶后的銀納米粒子的抗菌活性要高于單純的銀納米粒子，溶菌酶能夠顯著提高銀納米粒子的抗菌活性。關鍵詞：銀納米粒子；抗菌；細胞毒性；溶菌酶Designofantibacterialsilvernanoparticles-chitosan-lysozymecomplexAbstractSilvernanoparticlesarewidelyusedinmanyfields,especiallyinthefieldofantibacterial.Theantibacterialactivityofsilvernanoparticlescombinedwithlysozymewasstudiedinthispaper.Inthisexperiment,firstofall,wepreparedsilvernanoparticleswithdifferentparticlesizes.WetestedtheUV-Visabsorptionspectraofsilvernanoparticleswithdifferentparticlesizes.Subsequently,thesurfacemorphologyandparticlesizedistributionofsilvernanoparticleswithdifferentparticlesizesweremeasuredbytransmissionelectronmicroscopy(TEM)anddynamiclightscattering(DLS).WemixeddifferentconcentrationsofsilvernanoparticleswithE.coli(MG-1655)andcoatedthemonagarplates.Afterincubationforaperiodoftime,observethenumberofcoloniesontheplatetodeterminetherelationshipbetweenantibacterialactivityandconcentrationofsilvernanoparticles.Inordertomeasurethecytotoxicityofsilvernanoparticles,weusedCCK-8reagenttoexamintheeffectofsilvernanoparticlesoncellviability.Atlast,wecombinedlysozymewithdifferentconcentrationsofsilvernanoparticlesandusedthecoatingmethodtostudythebactericidaleffectofthecombinationoftwobactericidalsubstances.Theresultsshowesthattheantibacterialactivityandcytotoxicityofsilvernanoparticlesincreasedwiththeincreasingconcentration.Atthesametime,theantibacterialactivityofsilvernanoparticlescombinedwithlysozymeishigherthanthatofpuresilvernanoparticlesthatdonotbindlysozyme.Lysozymecansignificantlyincreasetheantibacterialactivityofsilvernanoparticles.Keywords:Silvernanoparticles,antibacterial,cytotoxicity,lysozyme緒論1.1銀納米粒子納米技術是21世紀的新興技術，廣泛應用于信息、生物、醫藥、化工、航空航天、能源和國防等的諸多領域[1]。銀納米粒子即尺寸在1-100nm之間的顆粒。由于其獨特的小尺寸效應、表面效應、宏觀量子隧道效應和量子尺寸效應等，成為這些年來研究的熱點。而其中的銀納米粒子材料更是其中使用最廣泛的納米材料。到目前為止，銀納米粒子已經在紡織行業，電鍍行業，防曬乳液，催化材料，電子產品等領域取得了長足的進步，但是人們最關心的還是銀納米粒子的抗菌作用[2]。在研究銀納米粒子的起初，研究者們發現了銀納米粒子對于細菌具有高強的殺傷力。隨著研究的持續深入，人們發現殼聚糖由于其獨特的陽離子效應，也具有一定的殺菌能力，并且由于殼聚糖具備綠色環保、可生物降解的優點使得人們開始思考如何將二者的優點結合起來制備更加優良的抗菌殺菌劑[3]。1.1.1銀納米粒子的應用到目前為止，由于銀納米粒子本身的出色性質，研究者們已經研究出很多種關于銀納米粒子的應用，其中包括醫療器械、高端銀漿、催化材料、新能源、電鍍行業等等。其中由于銀納米粒子是一種貴金屬粒子，有的人就用到了這個特性。Yu等[4]用銀納米粒子單步法催化刻蝕太陽能電池的減反層結構，可以將太陽能電池的效率從8.25%提升到10%。下圖1即單步法刻蝕硅表面的示意圖。此方法中用銀納米粒子制備硅表面微納結構，使得納米減反層的反射率在光譜300nm至1100nm范圍內降低了2%以下。大大提高了太陽能電池的效率。圖1.單步法刻蝕硅表面。同時，除了作為貴金屬粒子使用以外，有的人還發現銀納米粒子具有抗血小板作用和抗凝作用。例如麥麩木聚糖合成出的銀納米粒子具有較強的溶栓活性，可使血塊溶解，細胞分散，如下圖2所示。Shrivastava等[5]發現銀納米粒子能夠顯著減緩血栓中主要成分之一纖維蛋白的聚合，因為納米粒子會與纖維蛋白合成復合物，阻止纖維蛋白聚合，從而能夠產生較強的溶栓活性。圖2.血塊被用麥麩木聚糖作為穩定劑和還原劑合成的銀納米粒子處理前后的對照圖。有關銀修飾二氧化鈦提高光催化活性的研究，也已經有許多的文獻報道了。Wang等[6]通過對照實驗研究了自制介孔二氧化鈦和經銀納米粒子修飾過的二氧化鈦對甲基橙紫外光催化降解性能。如下圖3可見，銀納米粒子修飾過的二氧化鈦的光催化性能顯著增強。通過Wang等的研究發現，銀納米粒子的粒徑越小，越有利于二氧化鈦光催化活性的增高，這是因為附在二氧化鈦表面的銀的費米能級低于二氧化鈦，能夠有效的捕獲二氧化鈦產生的光生電子，使光生空穴向二氧化鈦納米粒子表面移動，提升了光生電子的量子產率，從而提高了二氧化鈦的光催化性能。圖3.不同樣品對甲基橙的光催化效果。1.1.2銀納米粒子的抗菌作用但是銀納米粒子應用最廣泛的用途是它的抗菌效應。在廣袤的中國大地上，經常會出現某些神奇的水井有著包治百病的功效，而導致這個的原因便是銀離子。通常，在地下河的通道中會出現銀礦，銀離子殺滅細菌，從而導致出現治病的效果。因此，古時候人們便把銀用作抗菌材料，至今已有幾百年的歷史。最近，由于納米材料的廣泛應用，銀納米粒子也逐漸進入人們的視野中。銀納米粒子對于細菌也具有相當大的毒性。Feng等[7]用殼聚糖作為保護劑和分散劑，通過液相還原法制備了水溶性銀納米粒子（CS/AgNPs），并通過化學鍵負載于脫脂棉表面，制備了表面負載CS/AgNPs的抗菌棉纖維，然后通過通過瓊脂板技術法，統計抗菌棉對于細菌的抑菌率，發現對于MRSA、E.coli抑菌率在99.8%以上,是一種強力且高效的抗菌棉，具有潛在的應用價值。銀納米粒子抗菌作用的機理盡管納米級銀對細菌活性的機制尚未完全闡明，但至今為止提出的三種最常見的產生毒性機理是：（1）游離銀離子的吸收和ATP的產生和DNA復制的中斷:Asharani等認為銀納米粒子會與O2和H2O反應生成銀離子，銀離子一直具有抗菌特性；同時銀離子會與呼吸鏈反應中的NADH脫氫酶相互作用，導致ATP合成失敗；此外，Ag+還會增加DNA在聚合酶鏈式反應中的突變頻率，導致DNA復制中斷。（2）銀納米粒子和銀離子生成活性氧：已知活性氧自由基會攻擊膜脂導致線粒體功能破壞或者DNA損傷，研究表明銀納米粒子會發生氧催化反應與谷胱甘肽相互作用，結合谷胱甘肽還原酶來抑制抗氧化防御，從而增加活性氧的產生。（3）銀納米粒子直接破壞細胞膜：其中一個假設是，納米顆粒和細菌細胞之間的相互作用是由于帶負電荷的細胞膜和帶正電的納米顆粒之間的靜電吸引[2]。還有人提出，銀納米粒子和膜細胞的相互作用的優先位點可能是含硫蛋白質——以類似的方式，銀與呼吸鏈蛋白的巰基和轉運蛋白相互作用，影響其正常的生理功能。盡管銀納米粒子與細胞質膜相互作用并且能夠穿透到細胞內的詳細機理尚未完全確定，但是很明顯的是附著于細胞膜上的銀納米粒子導致通透性增加，并且干擾其呼吸作用。銀納米材料和細菌細胞之間的各種觀察和假設的相互作用在圖4中得到了概念性的說明。圖4.納米銀與細菌細胞的相互作用示意圖。納米銀可能（1）釋放銀離子并產生活性氧;（2）與膜蛋白相互作用，影響其正常的生理功能;（3）積聚在細胞膜上，影響膜的通透性;（4）進入可以產生活性氧細胞內，釋放銀離子，影響DNA。產生的活性氧可能會影響DNA，細胞膜和膜蛋白，并且銀離子釋放可能影響DNA和膜蛋白[8][9]。銀納米粒子與蛋白質的結合形式隨著納米技術的快速發展，納米粒子與蛋白質結合相關的研究也越來越受到人們的廣泛關注。因為一方面，蛋白質可以授予納米粒子更高的穩定性和更豐富的生物活性；另一方面，納米粒子可以調控蛋白質的反應，制造出功能更加多樣化的蛋白質。銀納米粒子與蛋白質的結合形式一般可以分為四種[10]。它們分別是（1）靜電吸引，即帶電荷的蛋白質與銀納米粒子表面配體發生靜電相互作用使其結合在一起。Rotello等[11]通過納米粒子末端配體的電荷性質，將細胞色素C的特定位點靶向的結合在納米粒子表面，這就是利用了靜電吸引作用。（2）與銀納米粒子配體共價結合，除了與銀納米粒子的靜電吸引相互結合以外，還可以使得銀納米粒子配體與蛋白質發生共價結合。這種方法一般被用作納米粒子表面化學的極端修飾，例如Hainfeld等[12]利用高效液相色譜精確分離帶有一個反應基團的金納米粒子，通過此方法能夠很好的限制蛋白質在納米粒子表面的覆蓋率。（3）與蛋白質上輔因子特異性結合，輔因子功能化的銀納米粒子能有效的與相應的蛋白質發生特異性結合，例如生物素與鏈霉親合素的親合性相互作用被廣泛應用于生物活性納米粒子系統的構建。（4）直接與納米粒子表面結合，銀納米粒子還可以直接與蛋白質上的基團結合形成復合物，但是納米粒子表面的空間位阻效應將會是表面結合的關鍵問題。如果表面配體過多或者過長，那么目標的蛋白質殘基將會很難與粒子表面接觸，從而結合在一起。如下圖所示。圖5.蛋白質與納米粒子結合示意圖：（a）靜電吸附，（b）與納米粒子配體共價結合，（c）與蛋白質上輔因子特異性結合，（d）直接與納米粒子表面結合。1.1.3銀納米粒子的合成方法制備銀納米粒子的合成方法很多。大致分為物理法和化學法[13][14]。物理法是使用物理手段粉碎粒子從而得到納米粒子，其中包括激光燒蝕法、機械球磨法、電子束照射法等。雖然物理法制備銀納米粒子原理簡單，但是對于設備及儀器的要求比較高，價格昂貴。同時，得到的銀納米粒子的尺寸與形狀難以控制，比較適合于簡單的納米粒子的制備，對于要求精準的實驗還是需要化學方法來制備銀納米粒子[15][16]。傳統的化學方法有銀化合物分解法、電化學還原法、液相還原法、光化學還原法等，可生產出大量的大小形狀可控的銀納米粒子，制備工藝比較簡單且對于設備的要求不高，價格低廉[16][17][18]。在化學法制備銀納米粒子時，為了防止納米粒子團聚，得到粒徑粒徑可控的銀納米粒子顆粒，通常需要加入一定量的保護劑或者分散劑?；瘜W還原法制備單分散銀納米粒子Xing等[19]以聚乙烯吡咯烷酮為保護劑，水合肼為還原劑，AgN03溶液為銀源,采用化學還原法制備單分散的銀納米粒子，它們的粒徑分布均勻。Xing在常溫下稱量聚維酮（PVP）粉末，然后加入20mL蒸餾水，磁力攪拌使其完全溶解，然后加入一定量的質量分數為1%的AgNO3溶液，補充蒸餾水使其總體積達到45mL，繼續攪拌30min。接著量取一定量的水合肼溶液，加入一定量的蒸餾水使其總體積達到20mL，將水合肼溶液在1min內快速均勻的滴加到PVP-AgN03混合溶液中，在恒定溫度下反應1h，最終得到銀納米粒子溶膠。在溶膠中加入一定量的無水乙醇后，放入高速旋轉的離心機中，沉淀物用乙醇和丙酮洗滌三次后干燥，即可得到納米銀粉末。圖6即銀納米粒子的TEM圖。圖6.銀納米粒子的TEM圖和高分辨率透射電鏡圖。溶劑熱還原法制備銀納米粒子制備銀納米粒子的方法很多，還可以使用溶劑熱還原法制備銀納米粒子。Wang等[20]在乙醇/水溶液里加入AgNO3作為銀源，加入聚乙烯吡咯烷酮作為穩定劑制備銀納米粒子。他們首先稱量0.10g的PVP（K-30）放入20mL的乙醇中，使其混合均勻。再稱取0.017g的AgNO3加入到10mL的乙醇中，攪拌使其完全溶解，再逐滴緩慢滴入到上述混合均勻的PVP-乙醇混合溶液中，接著將混合液轉入總體積為40mL的內襯為聚四氟乙烯的高壓釜中，置于恒定溫度180℃下反應18h，在降低溫度到室溫后，放進高速離心機中進行離心分離。所得到的沉淀產物用去離子水和乙醇洗滌三次，在50℃下真空干燥即可得到想要的銀納米粒子。圖7即為銀納米粒子的TEM圖像。圖7.溶劑熱還原法制備得到的銀納米粒子的TEM圖?；跉ぞ厶沁€原的銀納米粒子的合成殼聚糖是一種從天然的甲殼素中提取的多糖聚合物，由于其存在活性氨基和羥基官能團，所以展現出獨特的聚集陽離子、螯合和成膜性質，而且其本身就存在一定的抗菌活性。Wei等[26]利用無毒、可生物降解的殼聚糖還原AgNO3從而制備出對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有高效抗菌活性的銀納米粒子。在一個基于殼聚糖的制備銀納米粒子的典型實驗中，Wei等將4mL，52mM/L的AgNO3和10mL，6.92mg/mL的殼聚糖溶液混合，并且攪拌均勻。然后，將上述混合物轉移到一個12.5×2cm的試管中，然后在95℃時放置12h。溶液的顏色從無色變為淡黃色，并且最終在反應開始后幾小時內轉變為棕黃色。由此獲得的銀試樣即是基于殼聚糖還原的制備而出的銀納米粒子。下圖即為銀納米粒子的TEM圖像。圖8.殼聚糖還原制備所得的銀納米粒子的TEM圖。1.2課題的提出1.2.1研究的目的及意義由于銀納米粒子在抗菌，催化和表面增強拉曼散射方面的重要應用，它已經引起人們深入研究的興趣[21][22]。銀已經被用作抗菌劑幾百年了，但最近一段時間人們發現濫用銀離子可能會增加細菌病毒的耐藥性[23][24]。人們普遍認識到，銀納米粒子可能附著在細胞壁上，從而干擾細胞壁的通透性和細胞呼吸。納米粒子也可能穿透到細胞內部，通過與含磷和含硫的化合物如DNA和蛋白質相互作用而對細胞造成損害[25]。同時使用銀離子作為抗菌藥物，也會受到銀離子在含有Cl-的生物和環境介質中的溶解度的限制，因為AgCl具有非常低的溶解度，并且會迅速的從溶液中沉淀出來。因此單獨的銀離子抗菌劑并不是一種特別良好的抗菌劑。殼聚糖，從天然的甲殼素中提取的一種多糖聚合物，由于活性氨基和羥基官能團的存在展現出獨特的聚集陽離子，螯合和成膜性質。殼聚糖也展現出許多有趣的生物學活性，包括抗菌活性，誘導植物抗病性，以及對多種人類細胞的不同刺激或抑制活性[26][27]。由于它的陽離子特性會導致膜的破壞，膜的破壞會導致細菌死亡，因此殼聚糖是一種安全無毒，可生物降解的優秀的抗菌劑。在考慮到殼聚糖與銀納米粒子各自的優缺點之后，我們有必要將二者的優點結合起來，提出一種制備更加優秀的抗菌劑的方法，同時通過實驗觀察銀納米粒子的殺菌活性和細胞毒性。1.2.2研究內容和實驗方法本實驗中，我們用通過殼聚糖還原法制備銀納米粒子，然后通過實驗測定銀納米粒子的表面形貌特征和它的粒度特征，選擇出合適的銀納米粒子。然后在通過銀納米粒子的抑菌和對細胞毒性測試的兩個實驗，判斷出單獨銀納米粒子對于細菌和細胞的毒性。最后，將銀納米粒子和不同濃度的溶菌酶結合在一起，混入大腸桿菌后涂布在固體LB培養基上，觀察MG-1655大腸桿菌的菌落，從而判斷出銀納米粒子結合溶菌酶的殺菌效果。殼聚糖還原制備銀納米粒子合成表征及性質測試2.1引言銀納米粒子由于其獨特的性質被廣泛應用于催化、能源、抗菌等方面。尤其是銀納米粒子的抗菌活性在近些年來更是被越來越多的人所重視。合成銀納米粒子的方法有很多，其中包括物理法中的機械球磨法、激光燒蝕法和化學法中的電化學還原法、光化學還原法等。其中使用殼聚糖還原硝酸銀（AgNO3）制備銀納米粒子的方法就是一種相當綠色環保的方法，同時由于殼聚糖本身就具有一定的抗菌殺菌活性，因此銀納米粒子的抗菌效果有望得到加強。在以往的研究中，Feng等[7]以殼聚糖作為保護劑和分散劑，通過液相還原法制備出了水溶性的銀納米粒子，然后通過化學鍵負載育脫脂棉表面，制備出了對于葡萄球菌和大腸桿菌具有良好抗菌效果的抗菌棉纖維。圖9.負載銀納米粒子前（a）和后（b）的掃描電鏡圖。銀納米粒子具有強效抗菌效果，但是同樣對于細胞也具有一定的毒性，因此銀納米粒子對于細胞毒性的測試也是不可避免的一項實驗。溶菌酶是一種能夠水解致病菌中黏多糖的堿性酶，對于細菌具有強效的殺菌效果，因此為了得到更加強力的殺滅作用，將銀納米粒子與溶菌酶結合起來就是一種理所當然的方法了[28]。同時，實驗的結果將有利于抗菌滅菌領域更加深入的研究。2.2材料與試劑實驗中所用的試劑如下表1所示，其中實驗中所需的菌株為大腸桿菌（E.coliMG-1655）由蘇州大學材料與化學化工學部生物大分子專業儲存備用。表1.實驗中所需試劑名稱及其生產廠家儀器名稱生產廠家硝酸銀（AgN03）分析純國藥集團化學試劑有限公司殼聚糖（Chitosan）（脫乙酰度≥95%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司氯化鈉（分析純）國藥集團化學試劑有限公司蛋白胨（分析純）英國OXOID公司酵母提取物（分析純）英國OXOID公司瓊脂粉（分析純）北京索萊寶科技有限公司2.3實驗儀器實驗中相關的儀器如下表2所示表2.實驗中所使儀器及其生產廠家儀器名稱生產廠家Milli-QBiocel超純水儀Millipore（美國）FA2104電子分析天平上海恒平科學儀器有限公司電熱恒溫水鍋上海精宏實驗設備有限公司UV-7504紫外分光光度計上海欣茂儀器有限公司VarioskanFlash多功能酶標儀美國ThermoScientific公司85-2型恒溫磁力攪拌器鞏義予華儀器有限責任公司空氣恒溫搖床上海新苗醫療器械制造有限公司高壓滅菌器上海中安醫療器械廠DF-101S智能恒溫加熱磁力攪拌器上海東璽制冷儀器設備有限公司KQ-100E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司101型電熱鼓風干燥箱北京市永光明醫療儀器廠微量移液器美國Gilson公司H-600透射電子顯微鏡（TEM）日本日立公司ZetasizerNano-ZS90動態光散射儀英國Malvern公司2.4銀納米粒子的合成提前用王水浸泡250mL圓底燒瓶，沖洗干凈，干燥。稱取6.9mg、8.65mg、11.5mg、17.3mg、34.6mg殼聚糖，加入9.9mL的超純水，0.1mL的乙酸混合均勻。提前攪拌過夜處理，增加溶解度。稱取1.766gAgNO3粉末并加入20mL超純水量取過夜處理的50mL溶液與AgNO3溶液混合在95℃下持續反應12h。即可得到所需的銀納米粒子。2.5適合銀納米粒子的選擇實驗吸取200μL樣品用多功能酶標儀在200-800nm范圍內測定紫外-可見吸收光譜。綜合考慮，從而判斷出適合接下來實驗的銀納米粒子的濃度。2.6銀納米粒子粒度表征首先使用動態光散射儀（DLS）測量銀納米粒子的水合粒徑。粒子表面形貌和實際粒徑的觀察采用透射電鏡（TEM）。將樣品滴在銅網上晾干，置于TEM下觀察。測量銀納米粒子的表面形貌和實際粒徑，進一步判斷銀納米粒子是否適合接下來的實驗。2.7銀納米粒子的抑菌實驗抑菌實驗主要選取了大腸桿菌（E.coli）(MG-1655)作為實驗材料，采用LB培養基培養。首先制備LB培養基，液體LB培養基是由去離子水400mL，4g蛋白胨，2g酵母提取物，4g氯化鈉組成的；固態LB培養基是由去離子水400mL，4g蛋白胨，2g酵母提取物，4g氯化鈉，6g瓊脂粉組成的。稱量混合均勻后的培養基均在高壓滅菌鍋內124℃下滅菌40min，取出后振蕩混勻備用。細菌的培養均采用少量的甘油菌與適量液體培養基混勻的方式，置于37℃振蕩培養箱中在190rpm振蕩培養14h。接著將銀納米粒子復合物分別稀釋8、10、20、50、100倍（保持銀納米粒子的最終濃度為0,0.8,1.6,4,8，10μg/mL）。測量大腸桿菌的OD值，之后通過計算將其稀釋到OD值為0.01（保證細菌的密度為107個/mL），每組試樣中加入50μL的大腸桿菌的菌液，再加入25μL的不同濃度的銀納米粒子（需要加入25μL的PBS作為對照），再加入425μL的PBS，每組至少三個平行試樣，在恒溫培養箱里培養2h后取出，取50μL稀釋100倍后涂布在固體LB培養板上，觀察實驗現象。2.8銀納米粒子對于細胞毒性的測試銀納米粒子對細胞的毒性主要通過CCK-8測試。將T25培養瓶內的L929細胞用1mL無菌PBS清洗一次，加入1mL胰蛋白酶并置于并放置于37℃恒溫培養箱培育3min，當在顯微鏡下觀察細胞呈亮球狀時將胰蛋白酶吸出，并加入2mL1640培養基吹打瓶底至細胞完全脫壁懸浮為止。隨后將細胞懸浮液轉移至離心管內在1200rpm下離心5min，除去上清液，再次以3mL1640培養基進行重懸。充分混勻后,取20μL細胞懸液與20μL胎盼藍溶液混勻，轉移至血球計數板內并采用正置顯微鏡進行計數。據此算得細胞密度之后以6000/孔的密度將細胞種到96孔板內，并使得孔內最終體積為200μL(含20μL胎牛血清，180μL細胞懸液和1640培養基)，隔天換液時加入納米粒子，使得最終濃度分別0，0.8,1.6,4,8,10μg/mL每種濃度設置三個平行樣。在培養至3天時進行CCK-8測試，向每個孔中加入100μL1640塔養基，10uLCCK-8溶液.向時留3個做空白對照(無細胞，僅有CCK-8與1640溶液)，在37℃培養箱中放置1h，用槍吹打，盡量使細胞脫壁。取100μL于新的96孔板中，在450nm下測得其吸收值并作圖。2.9不同濃度的銀納米粒子結合溶菌酶后的抑菌實驗稱量5mg溶菌酶，量取5mL的超純水混合均勻得到1mg/mL的溶菌酶溶液。然后在每個小試管中加入1mL使用34.6mg殼聚糖還原制備所得到的銀納米粒子，再加入0、5、10、20、30μL的溶菌酶溶液，最后分別按順序加入超純水30、25、20、10、0μL的超純水，振蕩10h后取出，離心機離心，吸取上清液，繼續加超純水補水到1mL處。從每個樣品中取500μL加水加到10mL（即稀釋20倍）,標記好順序。然后開始培養細菌，挑一點細菌到2mL液態LB溶液中，恒溫振蕩10h左右。取1mL菌液，放在離心機中離心，吸去上清液，加入PBS混合均勻，繼續離心重復上述操作。取100μL混合后菌液，加入400μLPBS使其稀釋5倍。取20μL稀釋后樣品測OD值，用PBS作為對照，測出稀釋5倍對應的OD值，計算出稀釋多少倍才能使其OD值等于0.01，用PBS稀釋。取50μL稀釋后樣品，再取25μL不同的銀納米粒子（需要加入25μL的PBS作為對照），再加入425μL的PBS，每組兩個平行樣。放在恒溫培養箱里培育2h。將樣品稀釋100倍后取50μL樣品涂布在板上，倒放，恒溫培育12h。觀察板上細菌的個數，并作圖。第三章結果與討論3.1銀納米粒子的紫外-可見吸收性質為了選擇出尺寸適合的銀納米粒子進行接下來的實驗，使用了紫外-可見吸收光譜來判斷出粒徑大小合適，分布均勻的銀納米粒子樣品。紫外-可見吸收光譜如圖10所示。圖10.五種樣品的紫外-可見吸收光譜。上圖的五條線A-E分別代表的是制備銀納米粒子時所加的殼聚糖的質量不同的樣品，它們的質量分別是6.92、8.65、11.5、17.3、34.6mg。圖中E樣品（34.6mg）在400nm左右有個強吸收峰，這一般被認為是銀納米粒子的表面等離子吸收。表面等離子共振強烈依賴于金屬粒子的形狀，球形粒子表現為單一的譜峰?？梢园l現E的譜線對稱且峰型較窄，表明此納米粒子單分散性較好，粒徑較均一，而A-D樣品的譜線較平緩且對稱性較差，表明A-D樣品的銀納米粒子的單分散性不及E的單分散性，而且粒徑也不均一。因此為了接下來的實驗，選擇E樣品（殼聚糖含量為34.6mg的制備所得的銀納米粒子樣品）。3.2銀納米粒子的形貌通過測量銀納米粒子的水合粒徑和實際粒徑來判斷殼聚糖質量為34.6mg的樣品是否適合進行銀納米粒子的抗菌試驗。通過使用透射電子顯微鏡觀察銀納米粒子的實際粒徑。銀納米粒子的TEM圖如下圖11所示。圖11.銀納米粒子的TEM圖。上圖觀察可以得到銀納米粒子的表面形貌及其實際粒徑。由圖11可知，銀納米粒子呈球狀且形狀較為規則，并沒有發生聚集現象，同時粒徑大小分布比較均勻，大約為10nm左右，因此從TEM圖觀察來看，此樣品適合接下來的實驗。動態光散射儀可以測量樣品的水合粒徑，測量樣品的圖如下圖12所示。圖12.銀納米粒子的粒徑分布。從上圖可以看出，34.6mg殼聚糖制備所得的銀納米粒子的樣品的水合粒徑分布大致在3-13nm左右，且主要分布在5-8nm，樣品的粒徑大小均勻，適合進行接下來的抗菌試驗。3.3銀納米粒子的抑菌性質銀納米粒子的抑菌實驗是觀察不同濃度的銀納米粒子對于大腸桿菌的滅殺效果。將加入不同濃度的銀納米粒子的大腸桿菌試樣涂抹在固體LB培養基上，實驗結果如下。圖13.不同濃度的銀納米粒子的涂板效果圖。圖14.銀納米粒子的抑菌率。圖中1#至6#樣品的銀納米粒子的最終濃度為0,0.8,1.6,4,8，10μg/mL。1#樣品是當銀納米粒子的濃度為0μg/mL時，即不存在銀納米粒子，抑菌率為零，不存在殺菌作用。2#樣品的銀納米粒子的濃度是0.8μg/mL，可以看出與不存在銀納米粒子的1#樣品相比，板上菌落顯著減少，抑菌率更是達到80%左右，殺菌效果顯著。隨著銀納米粒子的濃度增大，板上的細菌菌落越少，即殺滅的細菌越多，抗菌效果越好。6#樣品的銀納米粒子達到10μg/mL，板上菌落幾乎全部消失，同時抑菌率也達到100%，殺菌作用強大。因此可以得出結論：銀納米粒子的殺菌效果和抑菌率隨著銀納米粒子的濃度的增大而增加。3.4銀納米粒子的細胞毒性銀納米粒子的細胞毒性的測試主要通過Cell

Counting

Kit-8（簡稱CCK-8）試劑測試。其原理大致為該試劑會與細胞脫氫酶發生氧化反應生成具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazandye），而甲瓚物的數量和活細胞的數量成正比，因此數量越多則表示活細胞越多，細胞毒性差[29]。測量細胞毒性的實驗測量450nm的吸收值，結果如下圖所示。圖15.CCK-8細胞毒性測試450nm的吸收值。圖16.細胞存活率的變化圖。由于CCK-8試劑會與活細胞發生反應產生黃色甲瓚產物，因此黃色甲瓚產物越多，即表示著活細胞數量越多。同時黃色甲瓚產物越多，吸收波長就越多，吸光度就越大。因此吸光度越大即表示活細胞數量越多，細胞毒性越差。上圖15展示的是CCK-8實驗在450nm的吸光度。當銀納米粒子濃度為零時，吸光度最大，活細胞數量最多。隨著銀納米粒子濃度的增加，吸光度逐漸減小，細胞毒性增強。在銀納米粒子濃度達到8μg/mL時，溶液吸光度為零，表示細胞全部死亡。圖16表示的是細胞存活率的變化圖。從圖中可以看出，隨著銀納米粒子濃度的增加，曲線呈下降趨勢，細胞存活率在濃度為8μg/mL時變為零。因此最終得出結論：銀納米粒子的細胞毒性隨著濃度的增大而增加。3.5銀納米粒子結合溶菌酶的抑菌作用為了檢測銀納米粒子和溶菌酶同時作用的抗菌效果，我們將銀納米粒子和溶菌酶結合起來，將樣品與大腸桿菌混合，涂板后觀察菌落數目，得出其對大腸桿菌的殺菌效果。結果顯示如下圖17所示。圖17.不同濃度的銀納米粒子結合溶菌酶的涂板結果圖。圖中①號樣品是不加銀納米粒子和溶菌酶的樣品，②-⑤號樣品是加入1mL銀納米粒子后分別加入0、5、10、20、30μL的溶菌酶的樣品。結果顯示，①號樣品比②號樣品菌落多，可以得出結論：銀納米粒子對于大腸桿菌具有殺菌效果。通過將樣品②（溶菌酶的量為0μL）與樣品③進行對比，可以得出：銀納米粒子與溶菌酶結合后的抗菌效果是比純銀納米粒子要更強的。對于樣品③-⑤，可以看出，隨著溶菌酶濃度的增加，涂板上菌落的數目逐漸減小，銀納米粒子結合溶菌酶的抗菌效果逐漸增強。將涂板上的菌落數目計數清楚，使用公式殺菌率=（①號樣品菌落數-x號樣品菌落數）/①號樣品菌落數，可以計算出不同溶菌酶濃度的樣品的抑菌率，畫出如下圖18。圖中②號樣品對應橫坐標為零，意味著只有銀納米粒子而無結合溶菌酶的樣品，抑菌效率為57.84%?？梢钥闯觯S著結合溶菌酶量的增加，樣品的抑菌效率越高，殺菌作用越強，在結合溶菌酶含量達到30μL時，幾乎達到100%殺菌（99.65%）。圖18.不同濃度的溶菌酶的抑菌率。

第四章結論與展望4.1結論在本次實驗中，我們通過綠色環保的殼聚糖作為還原劑，AgNO3作為銀源，制得銀納米粒子；同時通過掃描透射電鏡和動態光散射儀觀察和測量制備所得的銀納米粒子的表面形貌和粒徑大小，通過此方法選擇形貌大小適合的銀納米粒子繼續接下來的實驗。制備出適合實驗的銀納米粒子之后，通過測量其對大腸桿菌（E.coliMG-1655）和L929細胞的殺滅效果，觀察銀納米粒子的抑菌效應及其對細胞的毒性。最后，我們將銀納米粒子與溶菌酶結合起來，加入到大腸桿菌（E.coliMG-1655）中，觀察最后生長出的菌落數目，得出銀納米粒子與溶菌酶的殺菌作用的規律。通過研究結論如下：（1）通過掃描透射電鏡等儀器的觀察，最后發現加入34.6mg殼聚糖制備所得的銀納米粒子表面形貌、尺寸大小正合適接下來的實驗；（2）通過抑菌實驗和對細胞毒性的實驗得出結論，隨著銀納米粒子的濃度增加，殺菌作用和對細胞的毒性變大；（3）在結合溶菌酶的實驗中，我們發現，在銀納米粒子結合溶菌酶后，它的殺菌效果顯著增強，同時隨著溶菌酶含量的增加，它的殺菌效果不斷增強。4.2展望隨著納米產業的蓬勃發展，銀納米粒子的殺菌作用越來越受到人們的關注。銀納米粒子具有殺菌作用，同時銀納米粒子結合溶菌酶的殺菌作用更強，因此在未來的生物、醫藥行業必然占據重要的位置。但是銀納米粒子對于細胞也具有一定的毒性，因此銀納米粒子的廣泛應用仍需要未來的人們做出更深的研究，揚長避短地在抗菌領域應用銀納米粒子。參考文獻1.KamatPV.Photophysical,photochemicalandphotocatalyticaspectsofmetalnanoparticles[J].JournalofPhysicalChemistryB,2002,106:7729-24.2.JonesCM,EHoeMV.Areviewoftheantibacterialeffectsofsilvernanomaterialsandpotentialimplicationsforhumanhealthandtheenvironment[J].JournalofNanoparticleResearch,2010,12:1531–1551.3.ShihC,ShiehY,TwuY.Preparationofgoldnanopowdersandnanoparticlesusingchitosansuspensions[J].CarbohydratePolymers,2009,78:309-15.4.余杭,丁夕然,白帆,李美成.形貌可控銀納米粒子制備及其在太陽能電池中的應用[J].中國科技論文,2012,7（2）:135-141。5.ShrivastavaS,SinghSK,MukhopadhyayA,etal.Negativeregulationoffibrinpolymerizationandclotformationbynanoparticlesofsilver[J].ColloidsandsurfacesB:Biointerfaces.2011,82;241-246.6.王旭珍.銀納米粒子的制備及其在光催化中的作用[J].功能材料,2009,40（9）:1573-1576。7.馮曉燕等.殼聚糖-銀納米粒子抗菌棉纖維滅菌機理初探[J].化工新型材料,2016,44（10）:204-206.8.DammC,MunstedtH.Kineticaspectsofthesilverionreleasefromantimicrobialpolyamide/silvernanocomposites[J].AppliedPhysicsA:MaterialsScience&Processing,2018,91:479–486.9.NealAL.Whatcanbeinferredfrombacterium-nanoparticleinteractionsaboutthepotentialconsequencesofenvironmentalexposuretonanoparticles?[J].Ecotoxicology,2008,17:362–371.10.Aubin-TamME,Hamad-SchifferliK.Structureandfunctionofnanoparticlesproteinconjugates[J].BiomedicalMaterials,2008,3(3):3400111.BayrakterH,YouCC,RotelloVM,etal.Facialcontrolofnanoparticlebindingtocytochromec[J].JournalofAmericaChemistrySociety,2007,129(10):2732-2733.12.HainfedJF,PowellRD.Newfrontiersingoldlabeling[J].JournalofHistochemistry&Cytochemistry,2000,48(4):471-480.13.DongCF,ZhangXL,CaiH,etal.Sodiumalginatemediatedrouteforthesynthesisofmonodispersesilvernanoparticlesusingglucoseasreducingagents[J].RareMetalMaterialsandEngineering,2016,45(2):261-266.14.ChenXY,ZhangP,CaiM,etal.Techniqueapproachofpreparinglow-temperaturesinteringofnanosilverpastewithreversemicroemulsionsystem[J].ElectronicComponents&Materials,2016,35(3):32-35.15.LuoQQ,LiKJ,PengLH,etal.Preparationandantimicrobialapplicationofsilvernanoparticlesmodifiedwithgallicacid[J].ChinaLeather,2016,45(5):5-9.16.DongCF,ZhangXL,CaiH,etal.Synthesisofmonodispersesilvernanoparticlesbywet-chemicalreductionmethod[J].FineChemicals,2013,30(10):1092-1095.17.PengC,ChenW,etal.Preparationsandcharacterizationofnano-silver[J].MaterialsChemist