1

細胞生物學研究方法

ExperimentalApproachesforStudyingCells2OUTLINE2.1顯微成像技術（TECHNIQUESOFMICROSCOPY）2.2細胞組分的分析方法（TECHNIQUESOFCYTOCHEMISTRY、CELLSORTING、ISOLATIONOFCELLCOMPONENT）

2.3細胞工程技術（CELLENGINEERING）2.4組學研究技術

(GENOME、TRANSCRIPTOMICS、PROTEOME)32.1TECHNIQUESOFMICROSCOPY

鏡像形成的三要素:

照明系統(illumination)

樣品(sample)

透鏡系統(optics)物鏡:

玻璃vs電磁透鏡目鏡：玻璃vs

熒光屏可見光

vs

電子束

Light

Electron

光學顯微鏡

電子顯微鏡(TheLightMicroscope)

(Electronmicroscope)42.1.1

光學顯微鏡（TheLightMicroscope）技術參數：

放大率(magnification,M) M=物鏡放大率X目鏡放大率

分辨率（resolution,R）:分辨出相鄰兩個物點間的最小距離

R=0.61λ/NA（λ:波長，可見光0.4~0.7μm）

顯微鏡的數值孔徑(numericalaperture,NA) NA=nsina（n，介質折射率;a，鏡口角）???最大分辨率a:70°n:1.5(油)λ:450nm(可見光)200nm(紫外光)5

常用光學顯微鏡：

◆普通雙筒顯微鏡

(binoularmicroscope) ◆相差顯微鏡:

(phasecontrastmicroscope) ◆微分干涉顯微鏡

(differentialinterferencemicroscope）

◆暗視野顯微鏡

(darkfieldmicroscope)

◆熒光顯微鏡

(fluorescencemicroscope) ◆激光共聚焦顯微鏡

(laserconfocalscaningmicroscope)6倒置顯微鏡正置顯微鏡7◆相差顯微鏡：(phasecontrastmicroscope)無色、透明、活細胞結構環形光闌（annulardiaphragm）相位板（annularphaseplate）標本密度不同導致光程差振幅差

8DIC◆微分干涉顯微鏡：(differentialinterferencemicroscope）

更強立體感，便于顯微操作9◆暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)：物體輪廓，無微細結構

丁達爾現象：光斜射到樣品上10◆熒光顯微鏡：(fluorescencemicroscope)紫外光源激發細胞內熒光標記染料ExcitationEmission11◆激光共聚焦顯微鏡：(laserconfocalscaningmicroscope)激光掃描、分辨力提高、可立體三維重建122.1.2電子顯微鏡

(Electronmicroscope)電子束波長比光短100000倍亞顯微結構（超微結構）：R<1nm

基本結構◆電子光學系統由照明系統、標本室、成像系統、觀察窗和記錄用的照相機等組成；◆真空系統是保持電鏡的真空度；◆電子學系統即供電系統，需要高壓穩壓。13電子顯微鏡種類：

◆透射電子顯微鏡：細胞內部結構觀察

(transmissionelectronmicroscope) ◆掃描電子顯微鏡：樣品表面形貌特征觀察

(scanningelectronmicroscope) ◆掃描隧道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

微觀世界物質表面特征，但樣品必須是導體 ◆原子力顯微鏡

(atomicforcemicroscope）

微觀世界物質表面特征，不要求導體，提供三維表面圖，不需樣品處理、常壓及液體環境中工作；但分辨率低于掃描電鏡142.2細胞組分的分析方法2.2.1細胞化學技術（cytochemistry）2.2.2細胞分選(cellsorting)2.2.3細胞組分的分離

(isolationofcellcomponent)

15◆酶細胞化學技術（酶與底物）

酶細胞化學技術就是通過酶的特異細胞化學反應來顯示酶在細胞內的定位。◆免疫細胞化學技術（抗原抗體）

利用免疫反應定位組織或細胞中的抗原成分分布

免疫熒光技術

免疫電鏡技術◆放射自顯影技術(radioautography)：利用放射性同位素標記研究細胞內大分子的合成動態（分布、定位、排出、合成等）◆其他：DNA、RNA染色:原位雜交技術(insituhybridization)2.2.1細胞化學技術（cytochemistry）Cellmorphology+cellcomponentanalysis162.2.2細胞分選(cellsorting)◆流式細胞術(Flowcytometry)干涉檢測器：發現細胞熒光檢測器：發現標記◆染色體分選(chromosomesorting)172.2.2細胞分選(cellsorting)◆流式細胞術(Flowcytometry)182.2.3細胞組分的分離

(isolationofcellcomponents)

超速離心技術(Ultracentrifugation)：分離細胞器與生物大分子及復合物◆速度離心：差速離心、移動區帶離心◆等密度離心：densitygradient層析分離技術(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)：分離蛋白質◆凝膠過濾(gelfiltration)：◆親和層析(affinitypurification)：◆離子交換層析(ion-exchangechromatography)19202.3細胞工程技術（CELLENGINEERING）2.3.1細胞培養(Cellculture)

體外細胞培養的條件

◆營養

◆環境因素∶

無菌環境、合適的溫度、一定的滲透壓和氣體環境、O2和CO2。后者對于維持細胞培養液的酸堿度十分重要。

◆代謝物和廢物排除

原代細胞(primarycells)：從機體分離取出，<10passages細胞系(cell

line)：原代培養物首次傳代成功后細胞株(cell

clone)：單細胞克隆CHO細胞的培養22胚胎干細胞（embryonicstemcell）體細胞（somaticcell）和干細胞(stemcell)Yamanaka/Jaenisch四因子實驗Oct4Sox2MycKlf4囊胚顯微注射嵌合體小鼠帶選擇標記的成纖維細胞iPS細胞移植誘導多能干細胞(induced

pluripotentstemcell,iPSC）24基因敲除示意圖（1）25基因敲除示意圖（2）262.3.2細胞融合與單克隆抗體

272.3.3基因轉染與敲除轉染(transfection)：將具有生物功能的核酸轉移或運送到細胞內并使核酸在細胞內維持其生物功能敲除(knockout）:顯微操作術(microinjection)動物細胞核移植克隆(Nucleartransfer)轉基因鼠及選擇性基因剔除(transgenicmiceandconditionalknockout)28細胞核移植克隆29KnockoutMiceThetechniqueusedtogenerateknockoutmicewasdevelopedinthelate1980sbyMarlo

CapecchiattheUniversityofUtah.

實驗分三步∶

◆構建重組載體；

◆轉基因敲除；

◆篩選。30基因敲除原理312.4組學研究技術

(GENOME、TRANSCRIPTOMICS、PROTEOME)GENOME：HighthroughputDNAsequencing…TRANSCRIPTOMICS:Geneexpressionarray/Chip…PROTEOME:proteinarray/Chip,tissueorcellchip,Massspectrometry…OUTLINE3.1細胞膜概述（INTRODUCTION

OF

CELL

MEMBRANE）

3.2膜的化學組成(THECHEMICALCOMPOSITIONOFMEMBRANES)3.3膜的分子結構及特點(MOLECULARSTRUCTUREOFTHEPLASMAMEMBRANE)3.4物質的跨膜運輸(PASSIVE

ANDACTIVETRANSPPORTOF

SUBSTANCES)3233細胞的生物膜體系

膜的結構

細胞質膜(PlasmaMembrane):

細胞表面

內膜系統（EndomembraneSystem)：

或胞質膜，細胞質內

生物膜(Biomembrane)：細胞所有膜結構343.1細胞膜概述（INTRODUCTION

OF

CELL

MEMBRANE）

2024/3/1835Commonfunctionsofplasmamembrane界膜和區室化;功能定位與組織化：Actaspermeabilitybarrierandtakepartinthecompartmentalizationofcell參與細胞間的相互作用；信號檢測與傳遞：Formspecificjunctionsbetweencells；Anchorcomponentsoftheextracellularmatrix；Containreceptorproteinsthatbindspecificsignalingmolecules能量轉換；調節運輸：Energytransduction，transport細胞壁的組裝:

Intimatelyengagedintheassemblyofcellwalls3.2膜的化學組成(THECHEMICALCOMPOSITIONOFMEMBRANES)

TheErythrocyteMembraneSkeleton◆MatureRedBloodCells: ■nointracellularorganelle

■plasmamembrane:theonlymembranestructure!!3637紅細胞血影38推測雙脂層的實驗：Langmuir水盤“脂單層”39

紅細胞膜脂雙層結構的研究

◆1925年兩位荷蘭科學家E.Gorter和F.Grendel根據對紅細胞質膜的研究發現紅細胞膜脂鋪展后面積與實際測量的表面積之比約為1.8～2.2∶1。

首次提出質膜的基本結構是脂雙層

(lipidbilayer)

？？Questions∶

◆行程∶500,000米

◆要多次穿過小于自身直徑一半的微小通道;

◆要在脾臟內經受少氧、低pH值的不利條件;

◆又要經過心臟內瓣膜渦流沖擊，但始終保持結構的完整。

40？？紅細胞膜僅僅是雙層脂？？41紅細胞膜蛋白其中有三種主要的蛋白*骨架蛋白：#血影蛋白*#血型糖蛋白*帶3蛋白*錨定蛋白#帶4.1蛋白#肌動蛋白#42ErythrocyteMembraneSkeleton

膜骨架：紅細胞膜內表面膜蛋白、纖維蛋白

3.2.1膜脂（MembraneLipids）maintypesofmembranelipids:◆甘油磷酯(phosphoglycerides)：◆鞘脂（sphingolipid）◆膽固醇（cholesterol）433.2膜的化學組成(THECHEMICALCOMPOSITIONOFMEMBRANES)脂類、蛋白質、糖類(lipids,proteins,saccharide)Phospholipid44Structureofmembranelipidamphipathicmolecules（兩性分子）hydrophilicheadgroup+hydrophobictailgroup45

Phosphoglyceride？？頭部尾部特性46PhosphoglycerideandSphingolipidsPhosphoglycerideSphingolipids47Sphingolipids◆磷脂(phospholipids)

動、植物細胞膜上都有磷脂,約占膜脂的50%以上；磷脂分子的親水端是磷酸基團，稱為頭部；磷脂分子的疏水端是兩條長短不一的烴鏈,稱為尾部,一般含有14～24個偶數碳原子；其中一烴鏈常含有一個或數個雙鍵,雙鍵的存在造成這條不飽和鏈有一定角度的扭轉；結構影響膜的流動性4849TypicalCholesterol◆膽固醇(Cholesterol)膽固醇存在于真核細胞膜中：●動物細胞膜膽固醇的含量較高●植物、細菌細胞膜多不含膽固醇●酵母細胞膜中是麥角固醇膽固醇分子包括三部分:

●極性的頭部：羥基

●非極性的類固醇環結構

●一個非極性的碳氫尾部。干擾磷脂脂肪酸尾部運動：調節膜流動性，增強膜通透性屏障50

膜脂的特性

膜脂的基本性質是“amphipathicmolecule”,能夠selfassemblingas雙層結構或自我封閉成球狀，受到損傷時可以自動再封閉。5152SelfAssemblyofLipidBilayer◆脂質體(Liposome)可用作生物膜的研究模型，并可作為生物大分子與藥物的運載體。

膜脂的功能◆構成膜的基本骨架,去除膜脂，則使膜解體;◆是膜蛋白的溶劑，一些蛋白通過疏水端同膜脂作用，使蛋白鑲嵌在膜上，得以執行特殊的功能;◆膜脂為某些膜蛋白(酶)維持構象、表現活性提供環境,一般膜脂本身不參與反應(細菌的膜脂參與反應);◆膜上有很多酶的活性依賴于膜脂的存在。有些膜蛋白只有在特異的磷脂頭部基團存在時才有功能。533.2.2膜糖（membranecarbohydrate）

◆存在方式：glycoprotein(93%)；glycolipid(7%)◆膜糖功能保護作用細胞與環境的相互作用2024/3/1855Structureofglycolipidmoleculesinplasmamembrane◆糖脂(Glycolipid)56糖脂普遍存在于原核和真核細胞膜上,含量約占膜脂的5%以下;最簡單的糖脂是己糖腦苷脂,它僅有一個己糖作為極性頭部;變化最多、最復雜的是神經節苷脂,它是神經原質膜具特征性的成分;保護細胞膜、信號識別。

Glycolipid

function:Protectionsignaltransduction3.2.3膜蛋白（membraneprotein）

◆存在方式：整合蛋白：跨膜蛋白，部分或全部鑲嵌在膜中外周蛋白：外露在膜的外側或內側，非共價鍵脂錨定蛋白：共價鍵方式與脂分子連接◆膜蛋白功能：運輸代謝連接信號轉導去垢劑可以破壞脂雙層溶解膜蛋白利用溫和去垢劑溶解、純化和重建功能膜蛋白的系統3.3.1STRUCTUREMODELS◆流動鑲嵌模型(Fluidmosaicmodel)◆脂筏模型(Lipidraftsmodel)3.3膜的分子結構及特點(MOLECULARSTRUCTUREOFTHEPLASMAMEMBRANE)1972年Singer和Nicolson提出了生物膜的“流動鑲嵌模型”，它的要點是：膜上脂質分子排成雙層構成生物膜的骨架，蛋白質分子以不同方式鑲嵌或聯結于脂雙層上；膜的兩側結構是不對稱的，膜脂和膜蛋白具有一定的流動性。Fluidmosaicmodelβ桶跨膜結構局限在細菌、線粒體和葉綠體的外膜上。跨膜a螺旋脂筏模型(Lipidraftsmodel)膜上一些特殊的脂質能形成稍厚的微區，這種大小約70納米的動態結構像筏子一樣，帶著大量的膜蛋白以集中完成各種復雜功能，這就是生物膜的脂筏模型。脂筏模型是對流動鑲嵌模型的補充!!!!!63具有較長的飽和脂肪酸鏈，分子間的作用力較強，所以這些區域結構致密，介于無序液體與液晶之間，稱為有序液體（Liquid-ordered）。在低溫下這些區域能抵抗非離子去垢劑的抽提，所以又稱為抗去垢劑膜（detergent-resistantmembranes，DRMs）。像一個蛋白質停泊的平臺，與膜的信號轉導、蛋白質分選均有密切的關系。脂筏中的膽固醇就像膠水一樣，它對具有飽和脂肪酸鏈的鞘磷脂親和力很高，而對不飽和脂肪酸鏈的親和力低。用甲基-β-環糊精（methyl-β-cyclodextrin）去除膽固醇，抗去垢劑的蛋白就變得易于提取。膜中的鞘磷脂主要位于外層，而且大部分都參與形成脂筏。脂筏的面積可能占膜表面積的一半以上。脂筏的大小是可以調節的。小的獨立脂筏可能在保持信號蛋白呈關閉狀態方面具有重要作用；當必要時，這些小的脂筏聚集成大一個大的平臺，在那里信號分子（如受體）將和它們的配件相遇，啟動信號傳遞途徑。脂筏特點：3.3.2膜的不對稱性（Membraneasymmetry）

研究方法：

冰凍蝕刻技術(Freeze-fracturereplication)

膜不對稱性的表現：◆膜脂不對稱性：脂雙層兩小葉（leaflet）中分布的各類脂的含量不同。◆膜蛋白的分布不對稱：在膜兩側分布不對稱，一般說,細胞質面的蛋白比外表面少,一些酶和受體多處于外表面。◆膜糖的不對稱：糖脂分布在動物細胞外表面，糖蛋白分布于脂膜雙層的外葉。

膜的不對稱性的意義：◆膜脂、膜蛋白及膜糖分布的不對稱性導致了膜功能的不對稱性和方向性,保證了生命活動的高度有序性。◆膜不僅內外兩側的功能不同,不同區域的功能也不相同。造成這種功能上的差異,主要是膜蛋白、膜脂和膜糖分布不對稱引起的。◆細胞間的識別、運動、物質運輸、信號傳遞等都具有方向性。這些方向性的維持就靠分布不對稱的膜蛋白、膜脂和膜糖來提供。

1970年，LarryFrye和MichaelEdidin進行了鼠、人細胞融合實驗，令人信服地證明膜的流動性。3.3.3膜的流動性（MEMBRANEFLUIDITY）

膜脂的運動方式

◆側向擴散(lateraldiffusion)

◆旋轉(rotation)

◆翻轉(flip-flop)

◆屈曲(flexion)使用熒光漂泊再恢復方法來測定膜上脂質的側向擴散70

影響膜流動性的因素：

膜的流動性依賴于膜的組分和溫度。

◆相變溫度（transitiontemperature）在生理條件下,膜脂多呈擬液態（liquid-likestate）。溫度下降至某點,則變為晶態（frozencrystallinegel）。一定溫度下,晶態又可熔解再變成液晶態，這種臨界溫度稱為相變溫度。◆相變(phasetransition)在不同溫度下發生的膜脂狀態的改變稱為相變。不同的膜脂由于成分不同而各有其相變溫度。71◆膜脂肪酸鏈對膜流動性的影響：不飽和程度和鏈的長短碳氫鏈較短或者含有雙鍵，相變溫度就會降低，這樣膜在較低的溫度下還可以保持流動性。較短的鏈減少了同一層或者雙層之間碳氫鏈的相互作用。順式雙鍵使得碳氫鏈產生彎折難以相互堆積。◆膽固醇使得脂質在雙層中堆積更為緊密，提高穩定性及有序性可塑分子：在相變溫度以上,它可使磷脂分子的脂酰鏈末端的運動減小,即限制膜的流動性。在相變溫度以下,可增加脂類分子脂酰鏈的運動,這樣可以增強膜的流動性。72◆卵磷脂/鞘磷脂比值對膜脂流動性的影響卵磷脂所含的脂肪酸鏈的不飽和程度高,鏈較短,相變溫度低,因此卵磷脂含量高,流動性大。而鞘磷脂的脂肪酸鏈的飽和程度高,相變溫度也高,因此,鞘磷脂的含量高,流動性低。◆膜蛋白對膜脂流動性的影響73

影響膜蛋白流動性的因素 ◆整合蛋白相互間的影響 ◆膜骨架的影響 ◆細胞外基質的影響 ◆相鄰細胞的影響 ◆細胞外配體、抗體、及藥物大分子的影響

膜蛋白的運動方式

◆隨機

◆定向

◆局部細胞外基質對整合蛋白移動的影響膜骨架對膜蛋白流動性的影響

膜的流動性的意義：

◆酶活性 ◆物質運輸

◆能量轉換

◆信號轉導 ◆細胞周期 在M期,膜的流動性最大,而在G1期和S期,膜流動性最低；

3.4物質的跨膜運輸(PASSIVE

ANDACTIVETRANSPPORTOF

SUBSTANCES)77生物大分子:膜泡運輸(vesicle

transport)

離子及小分子:穿膜運輸Phagocytosis78脂雙層具有半通透性質：極性分子，只能很慢地穿過合成脂雙層，但膜上有一些特別的蛋白幫助這些分子跨膜運輸。膜蛋白的主要功能就是跨膜運輸營養分子、排出代謝廢物以及調節胞內的離子濃度，這些跨膜運輸蛋白占膜蛋白的15-30%。離子及小分子:穿膜運輸

兩類主要的跨膜運輸蛋白轉運蛋白（transporter）和通道蛋白（channel）轉運蛋白：跨膜運輸分子的過程類似酶和底物的反應，有最大運輸速率和親和反應常數，被運輸小分子的結合還可以被競爭性或非競爭性的抑制劑所抑制，不同的是轉運蛋白并不會改變被運輸的小分子。通道蛋白：與溶質分子的結合能力非常弱，它們形成狹窄的跨膜水溶性通道，在通道開放時允許特定的溶質分子（通常是一些小的無機離子）穿越通道。與轉運蛋白相比，通道蛋白的運輸速率要高4到8個數量級。被動運輸和主動運輸被動運輸（passivetransport):分子或離子順電化學梯度跨膜運輸，不需要消耗另外的能量，包括簡單擴散和易化擴散。主動運輸（activetransport)：需要提供額外的能量、逆著電化學梯度跨膜運輸。主動運輸是由一些稱作泵（pump）的轉運蛋白完成的，它們有很強的方向性。3.4.1被動運輸3.4.1.1

簡單擴散（simplediffusion）指被動運輸不需要膜蛋白的幫助，但不額外消耗能量。僅靠膜兩側保持一定的濃度差,通過擴散發生的物質運輸。◆限制因素■脂溶性∶

細胞質膜的通透性具有選擇性。

■Size

：質膜的通透性孔徑不會大于0.5-1.0nm，能夠擴散的最大分子是水分子。■Polarity∶極性物質通常同水結合形成一個水合的外殼，這不僅增加了它們的分子體積，同時也大大降低了脂溶性。3.4.1被動運輸3.4.1.2

易化擴散（facilitateddiffusion）指被動運輸需要膜蛋白的幫助，順濃度梯度或電化學梯度，但不額外消耗能量。

促進擴散的特點：

Similarinmanywaystoanenzyme-catalyzedreaction

◆速度快，要比自由擴散快幾個數量級；◆自由擴散的速率與溶質的濃度成正比，而膜蛋白促進的運輸可以達到最大值；◆具有特異性;◆運輸作用受抑制劑的抑制。3.4.1被動運輸

通道蛋白與易化擴散◆通道蛋白形成的通道又叫閘門通道(gatedchannels)，是通道蛋白進行的間斷開放通道。■配體閘門通道(Ligand-gatedchannels)■電位閘門通道(Voltage-gatedchannels)■牽張閘門通道(Stretch-gatedchannels)

載體蛋白與易化擴散◆載體蛋白需要同被運輸的離子和分子結合，然后通過自身的構型變化或移動完成物質運輸。載體蛋白特點:■高度特異性■載體蛋白既參與被動的物質運輸，也參與主動的物質運輸。3.4.2主動運輸主動運輸的特點:■逆梯度運輸■依賴于膜運輸蛋白■需要代謝能■耗能選擇性和特異性主動運輸的意義:■保證細胞及細胞器從周圍環境中或細胞表面攝取必需的營養■能將細胞內的各種物質排到細胞外■能夠維持一些無機離子在細胞內恒定和最適濃度

主動運輸方向：單向轉運（cotransport),偶聯轉運（coupling

transport)。

根據能量的來源在細胞中有三種主動運輸的方式：偶聯轉運，ATP驅動泵和光驅動泵。LightelectrochemicalgradientLightpoweredpump88

偶聯運輸

又稱協同運輸。這種運輸需要先建立離子學梯度(Iongradients)，在動物細胞主要是靠Na+泵、在植物細胞則是由H+泵完成的。

協同運輸的方向分為：◆同向協同(symport)：

動物細胞的葡萄糖和氨基酸就是與Na+

同向協同運輸。◆反向協同(antiport)：

H+

與Na+

的反向協同。運輸：H+,Na+,K+,Ca2+H+onlyIonsandvarioussmallmoleculesATP驅動的主動運輸利用ATP水解成ADP和磷酸所釋放出來的能量跨膜主動運輸物質的蛋白叫做ATP驅動泵，也稱為轉運ATP酶，它在原核細胞和真核細胞中廣泛存在。2024/3/1890三類ATP泵ClassExamplesP-ClassPlasmamembraneofplants,fungi,bacteria(H+pump),Plasmamembraneofhighereukaryotes(Na+/K+pump),Apicalplasmamembraneofmammalianstomach(H+/K+pump),Plasmamembraneofalleukaryoticcells(Ca2+pump),Sarcoplasmicreticulummembraneinmusclecells(Ca2+pump)V-ClassVacuolarmembranesinplants,yeast,otherfungi,Endosomalandlysosmalmembranesinanimalcells,Plasmamembraneofosteoclastsandsomekidneytubulecells.F-ClassBacterialplasmamembrane,Innermitochondrialmembrane,ThylakoidmembraneofchloroplastABC-ClassBacterialplasmamembranes(aminoacid,sugar,andpeptidepermeases),Mammalianplasmamembranes(transportersofphospholipids,smalllipophilicdrugs,cholesterol,othersmallmolecules)P型泵-鈉鉀泵P型泵在泵循環過程中會自我磷酸化，由多次跨膜蛋白構成，包括很多負責建立和維持跨膜鈉離子、鉀離子、質子和鈣離子梯度的主動運輸蛋白。也叫做鈉鉀ATP酶，它利用ATP水解的能量逆電化學梯度將鈉離子運出細胞、將鉀離子運進細胞。當鈉離子和鉀離子的濃度梯度增加到一定程度，使得電化學梯度的能量比ATP水解的化學能更高的時候，鈉鉀泵就可以反向作用，利用這些離子順電化學梯度擴散的能量來產生ATP。總的自由能變化是用于合成ATP還是泵出鈉離子，取決于ATP、ADP和磷酸根的相對濃度，以及鈉離子和鉀離子的電化學梯度。F/V型泵-ATP合成酶F型泵是由不同亞基組成的形狀像渦輪機的蛋白。在細菌的質膜、線粒體內膜和葉綠體類囊體膜上發現，通常也被稱作ATP合成酶，它們利用質子的跨膜梯度驅動ATP合成。質子梯度的形成來源于厭氧細菌和線粒體中的氧化磷酸化過程，或者是植物葉綠體中光合作用中的電子運輸，也可以是嗜鹽菌中光驅動的質子泵形成的。

V型ATP泵與F型ATP泵結構類似，它們通常是利用ATP水解的能量來驅動質子運輸，將質子泵進細胞器（例如溶酶體，突觸囊泡和植物的液泡），酸化這些細胞器的內部環境。V型ATP泵與膜上鈉離子濃度梯度驅動運輸質子的主動轉運蛋白一起，來共同調節膜內的pH環境。ABC轉運蛋白–多藥抗性蛋白ABC轉運蛋白是膜轉運蛋白中的一個大家族，跨膜轉運種類繁多的分子，包括無機離子、氨基酸、單糖、多糖、小肽甚至是蛋白質。ABC轉運蛋白有兩個高度保守的ATP結合區（ATP-bindingcassette），結合ATP可以使該區域二聚化，水解ATP使得這個結合區解聚。在胞內發生的這種結構變化被認為可以傳遞到跨膜區，使得蛋白構象循環變化，可以將底物結合的位點交替地朝向膜內和膜外。通過這種方式，ABC轉運蛋白利用結合ATP和水解ATP來跨膜運輸多種多樣的小分子。金黃色葡萄球菌中的多藥抗性蛋白，顯示了結合ATP后的構象。Nature443:156,180(2006)光能驅動的主動運輸一些細菌和古細菌能利用光能作為能量來源，驅動跨膜的離子運輸。它們通常需要一個特別的可以吸收光子的生色團分子（如蛋白質-細菌視紫紅質（bacteriorhodopsin）的視黃醛（retinal）生色團），當被一個單光子激活時，它會改變形狀并引起蛋白中一系列的構象變化，使得一個質子從細胞內轉移到細胞外。并將光能轉化為生物可以直接利用的化學能。光驅動的質子轉移在細菌質膜兩邊建立起質子濃度梯度，它可以被F型ATP泵利用來合成ATP，也可以作為細菌中其它活動的能量來源。跨膜運輸的方式Over360familiesoftransporterhavebeenidentifiedthroughbiochemicalandgenomicanalysis.TransportProteinDatabase:/tcdb96動物、植物細胞主動運輸的比較OUTLINE4.1

細胞表面(CELL

SURFACE)4.2

細胞外基質

(EXTRACELLULAR

MATRIX,ECM)4.3細胞識別、黏著與連接(CELLRECOGNITION,ADHESIONANDJUNCTION)97Anoverviewofcellsinteractwiththeirenvironment

4.1CellSurface●細胞被(cellcoat)●細胞質膜(cytoplasmicmembrane)●保護細胞,使細胞有一個相對穩定的內環境；●參與細胞內外的物質交換和能量交換；●參與信號的識別和信息的傳遞；●參與細胞運動；●維護細胞的各種形態；與免疫、癌變等有十分密切關系。◆結構：◆功能：Electronmicrographofthesurfaceofalymphocyte4.1.1CellCoat

細胞被(cellcoat)or多糖包被或糖萼(Glycocalyx)●組成：“糖”●功能：

mechanicalprotectioncell-cellandcell-substratuminteractions

纖維素(cellulos):

葡萄糖多聚體

半纖維素(Hemicellulose)：不同類型單糖的異質多聚體

果膠(pectin)：半乳糖醛酸及其衍生物多聚體

木質素(lignin)：聚合芳香醇

糖蛋白(glycoprotein)：extensin4.1.2PLANTCELLWALLS

細胞壁的結構組成

(植物)細胞壁=(動物)細胞外基質多糖蛋白質分子

CELLWALLSLAYERSofPLANTCELLWALLS主要是果膠在細胞停止生長后分泌形成的

植物細胞壁的分泌合成◆中間層形成：

主要是果膠。果膠是相鄰兩細胞壁所共有，并且具有將兩個細胞連接在一起的作用。◆初生壁形成：

是細胞正在生長時形成的。初生壁由纖維素、半纖維素、果膠和糖蛋白等松散組成。◆次生壁形成：

是在細胞停止生長后分泌形成的。主要是增加細胞壁的厚度和強度。次生壁主要成分是纖維素和木質素。

植物細胞壁的作用◆提供機械強度◆植物細胞壁是一個動態結構，能夠進行很多活動:●與細胞壁有關的酶能夠吸收細胞外的營養，生成能夠通過細胞膜進入細胞的小分子化合物。●細胞壁也可以作為物質通透的障礙，在代謝和分泌過程中起重要作用。4.1.3BACTERIACELLWALLS

細胞壁的結構組成

Gram-positivevsGram-negativeN-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替連接形成胞壁質多糖鏈通過N-乙酰胞壁酸與肽橋結合

胞壁質(murein):肽聚糖(peptidoglycan)？青霉素的作用4.2Extracellularmatrix◆細胞分泌的大分子在細胞間交織連接成網狀結構，稱ECM

細胞外基質的組成∶●蛋白聚糖(proteoglycan)●結構蛋白(structureprotein)：膠原和彈性蛋白，它們賦予基質一定的強度和韌性。●黏著蛋白(adhesiveproteins)：纖連蛋白和層粘蛋白，它們促使細胞同基質結合。◆維持細胞形態及活性，信號轉導，細胞分化….TypicalECM4.2.1蛋白聚糖(Proteoglycan,PG)●coreprotein+glycosaminoglycans(GAGs,糖胺聚糖)

，構成ECM的基質

糖胺聚糖

(Glycosaminoglycans)●重復二糖單位構成無分支長鏈多糖●二糖單位之一是氨基己糖(氨基葡萄糖或氨基半乳糖),故稱為糖胺聚糖。●二糖單位包括∶硫酸軟骨素(chondroitinsulfate)

透明質酸(hyaluronicacid)…..構成糖胺聚糖的二糖

透明質酸(hyaluronicacid)不同于其他PG，在細胞外基質中也可游離存在。作為長軸，將蛋白聚糖連接在一起。

透明質酸-蛋白聚糖復合物。4.2.2結構蛋白

膠原(Collagen)●water-insolublefibrousglycoproteins,thebackboneproteinsforECM.●mostabundantproteininthehumanbody(>25percentofallprotein)withhightensilestrength:collagenfiber(Φ1mm)

suspending10kg.●producedprimarilybyfibroblasts,andalsobysmoothmusclecellsandepithelialcells.●tropocollagenconsistingofthreeapolypeptidechains(Gly-X-Y)nStructuralfeatures原膠原的三條鏈之間的賴氨酸(lysine)殘基間的交聯不同原膠原間的賴氨酸交聯◆膠原的組裝◆膠原的合成、裝配與運輸◆膠原的作用

●膠原是骨、腱和皮膚組織中的主要蛋白，在這些組織的細胞外基質中,膠原起著細胞外基質骨架作用；

●膠原具有促進細胞生長的作用；

●維持并誘導細胞分化的作用。皮膚過渡松弛癥膠原酶的遺傳缺陷，膠原纖維不能正確地裝配

彈性蛋白(Elastin)◆是彈性纖維(elasticfibers)的主要成分。◆功能：能夠賦予細胞外基質彈性。◆富含甘氨酸和脯氨酸的蛋白質。◆與膠原不同：彈性蛋白沒有羥基化，所以沒有羥賴氨酸的存在。彈性蛋白的結構4.2.3黏著蛋白(adhesiveprotein)細胞外基質與細胞聯系的橋梁，促進細胞同基質結合

纖連蛋白(Fibronectin,FN)

層連蛋白(laminin,LN)Fibronectin◆功能：◆RGD序列，介導細胞的黏著。◆具有同時與細胞外基質各類成分相結合的特點,是細胞外基質的組織者。Laminin◆功能◆基膜的主要結構成分對基膜的組裝起關鍵作用。◆介導細胞黏著于膠原,使之發生鋪展。

基膜(Basementmembrane)◆細胞外基質特異區：上皮和內皮的基底面4.2.4

細胞外基質與細胞的相互作用■層連蛋白：是基膜的主要成分，也是基膜的組織者；■Ⅳ型膠原■巢蛋白(entactin)■硫酸肝素糖蛋白基膜的結構Ⅳ型膠原是基膜的核心分子，排列成網狀；層粘連蛋白同Ⅳ型膠原結合，覆蓋在細胞表層。

整聯蛋白(integrin)◆細胞外基質受體◆受體濃度高，與配體結合力低◆胞外端同基質蛋白結合◆胞內尾部與肌動蛋白結合◆細胞外基質與細胞內骨架雙向聯絡，即細胞黏著◆信號傳遞整聯蛋白與細胞外基質相連RGD序列：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)4.3

CELLRECOGNITIONANDADHESION后

細胞的黏著(CellAdhesion)在細胞識別的基礎上,同類細胞發生聚集形成細胞團或組織的過程。先

細胞的識別(CellRecognition)細胞對同種或異種細胞、同源或異源細胞以及對自己和異己分子的認識和鑒別。

細胞的識別◆抗原-抗體的識別◆酶與底物的識別◆細胞間的識別基本特性：選擇性-特異性！！！揀出(sortingout)4.3.1

CELLRECOGNITION

細胞識別與黏著的分子基礎

識別反應

細胞識別引起的細胞反應,大致有三種類型: ◆內吞 ◆細胞黏著 ◆信號反應糖-識別蛋白-黏著

細胞黏著◆概念：在細胞識別的基礎上,同類細胞發生聚集形成細胞團或組織的過程。◆引起細胞黏著的主要是膜蛋白-細胞黏著分子(celladhesionmolecule,CAM）。4.3.2

CELLADHESION◆選擇蛋白(Selectins);◆免疫球蛋白超家族(Immunoglobulinsuperfamily,orIgSF);

◆整合素(Integrins);

◆鈣黏著蛋白(Cadherins)。其中①、③、④是鈣依賴性的，②為鈣非依賴性的◆細胞黏著的方式◆由同種細胞黏著分子介導◆由互補的細胞黏著分子介導◆由中介分子與細胞表面黏著分子介導鈣黏著蛋白自我黏著同類細胞的揀出選擇蛋白與細胞黏著識別特異性的糖基免疫球蛋白超家族同嗜性黏著或異嗜性黏著

細胞黏著小結共有六種不同的方式的細胞黏著：？四種細胞間黏著？兩種細胞與細胞外基質的黏著

細胞的六種黏著方式4.3.3CellJunction細胞連接的概念：細胞表面的特化結構，或特化區域。兩個細胞通過這種結構連接起來。與細胞黏著的關系：黏著在前，連接在后。CellJunction類型：◆緊密連接(tightjunction)：封閉◆斑形成連接(plaque-bearingjunction)：黏著◆間隙連接(gapjunction)：通訊

存在部位和結構特點◆又叫不通透連接(impermeablejunction),它不僅連接相鄰的細胞,而且封閉細胞間隙,使大多數分子難以在細胞間通透。◆這種連接方式普遍存在于腔道上皮細胞靠近管腔端的相鄰細胞膜間。◆從結構上看,通過連接蛋白形成焊接線，封閉相鄰細胞間的空隙。緊密連接(tightjunction)緊密連接縫合蛋白(occludin)密封蛋白(claudin)

緊密連接的功能◆連接作用◆防止物質雙向滲漏，◆維持細胞的極性，并限制了膜蛋白在脂分子層的流動◆又稱錨定連接(anchoringjunction)；◆主要靠黏著蛋白、整聯蛋白和細胞骨架體系將相鄰兩細胞或細胞與細胞外基質連接在一起。◆斑塊連接分為：

●黏著連接(adherensjunctions)細胞間的連接作用與細胞骨架系統的肌動蛋白相關稱為黏著連接。（黏著帶+黏著斑）●橋粒(desmosome)

細胞間的連接作用與細胞骨架系統的中間纖維相關稱為橋粒。（橋粒+半橋粒）

斑塊連接(plaque-bearingjunction)黏著帶(Adhesionbelts)細胞-細胞間黏著鈣黏蛋白同肌動蛋白相互作用黏著斑(Focaladhesion)細胞-細胞外基質進行連接細胞外基質中的纖連蛋白通過整聯蛋白同肌動蛋白相互作用黏著連接的作用橋粒(desmosomes)細胞-細胞間黏著鈣黏著蛋白同中間纖維相互作用半橋粒(Hemidesmosomes)細胞-細胞外基質間黏著整聯蛋白同中間纖維相互作用CommunicationJunction◆一種特殊的細胞連接,位于特化的具有細胞間通訊作用的細胞

◆具機械的細胞連接作用◆在細胞間形成電偶聯或代謝偶聯,以此來傳遞信號

◆通訊連接的方式：●間隙連接(gapjunction)：動物●胞間連絲(plasmodesma)：植物

間隙連接(gapjunction)◆Connexons●一種跨膜結構●每個連接子由6個相同或相似連接蛋白

(connexin)亞單位環繞中央形成孔徑為

1.5-2nm的水性通道；●相鄰兩細胞分別用各自的連接子相互對接形成分子間的通道，允許分子量在

1200道爾頓以下的分子通過。間隙連接◆間隙連接的主要功能：●機械連接作用；●電偶聯（Electricalcoupling）：在神經沖動信息傳遞過程中起重要作用●代謝偶聯（Metaboliccoupling）代謝偶聯可允許小分子代謝物和信號分子通過間隙連接

胞間連絲(plasmodesmata)◆胞間連絲的結構∶●是相鄰植物細胞壁上的一個狹窄細胞壁通道●有管狀的內質網通過。因此，通過胞間連絲，使得相鄰細胞的細胞質膜、細胞質、內質網交融在一起●胞間連絲直徑約30-60nm，允許1000道爾頓以下的分子滲透及大分子的運輸。胞間連絲（Plasmodesmata）突觸（

synapse）Figure19-22cMolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)？細胞連接的不同方式163OUTLINE5.1

BASICCHARACTERISTICSOFCELL-SIGNALINGSYSTEMS

5.2 GPROTEINCOUPLEDRECEPTOR5.3 SIGNALINGVIAENZYME-LINKEDRECEPTORSANDOTHERSIGNALINGPATHWAY5.4 SIGNALCONVERGENT、DIVERGENT、CROSSTALKANDCELLADAPTATION信號出現傳遞消息決策執行功能信息感受信息傳遞命令傳遞日常生活中的信息傳遞細胞通訊：CellCommunication165細胞通訊：CellCommunication細胞間或細胞內通過高精度和高效的接收信息通訊機制并通過放大引起快速的細胞生理反應/或引起基因活動，從而發生一系列的細胞活動來協調各組織行動，使之成為統一生命整體對外界環境變化作出綜合應答。166CellSignal：信號的產生及傳送

synthesisofsignalmolecule

release

transport

CellCommunicationReactionSignalTransduction：信號的接收、轉換、應答

signalrecognition

transduction

responseTransductionSignalmoleculesrecognition(receptor)ReactionSIGNALINGCOMPONENTSFourTypesofCellCommunicationCell-SurfaceReceptorsFallintoThreeMainClassesTheBasicCellSignalingProcess(A)Contact-dependent:don’tneedsecretedmolecule(B)Papacrine:tonearbyneighbor(C)Neuronalsignaling(D)Endocrine:tolongdistanceFromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition))Signalcanactoverlongorshortrange.FourTypesofCellCommunicationFromEssentialCellBiology(?GarlandScience2010)FromEssentialCellBiology(?GarlandScience2010)1715.1.1

CellSignalingandSignalmolecule不依賴于細胞接觸：依賴于細胞接觸：172TransductionSignalmoleculesrecognition(receptor)Reaction5.1.2

SignalRecognitionandReceptors受體（receptor）：任何能夠與信號分子結合并能

引起細胞功能變化的生物大分子。173接收信息→受體信號分子→配體(ligand)

FromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition)1.Anion-channel-coupledopensorclosesinresponsetobindingofitsextracellularsignalmolecule.Thesechannelsarealsocalled‘transmitter-gatedionchannelsCellsurfacereceptorsfallintothreebasicclasses

FromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition)G-protein-coupledreceptor:WhenaG-coupledreceptorbindsitsextracellularsignalmolecule,thesignalispassedfirsttoaGTP-bindingprotein(Gprotein)thatisassociatedwiththereceptor.TheactivatedGproteinthenleavesthereceptorandturnonatargetenzyme(orionchannel)inthemembrane

FromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition)3.Enzyme-coupledreceptors:Anenzyme-linkedreceptorbindsitsextracellularsignalmolecule,switchingonanenzymeactivity,eitherattheotherendoftheenzymeorotherassociatedenzyme177Cell-surfaceReceptors（受體本身就是離子通道的一部分）（GTP結合的調節蛋白偶聯）（受體本身就是酶，又稱催化受體）178IntracellularReceptorsTwo

motifs,twobindingsites179180GenerationofconditionalknockoutmiceER-Cre/tamoxifen181TransductionSignalmoleculesrecognition(receptor)Reaction1825.1.3

SignalTransduction信號轉導：細胞表面受體通過一定機制將外部信號轉為內部信號。

Manyintracellularsignalingproteinsactasmolecularswitches:Signalingbyphosphorylation:signalingproteinsareactivatedbytheadditionofaphosphategroupbyproteinkinase,andinactivatedbyremovalofthephosphatebyproteinphosphatase.Proteinkinasephosphatesserine/threonine(calledser/thrkinase)ortyrosine(calledtyrosinekinase)(B)SignalingbyGTP-bindingprotein:aGTP-bindingsignalingproteinisinducedtoexchangeitsboundGDTforGTP(i.e.addsaphosphatetotheprotein).ThehydrolysisoftheboundGTPtoGDPThenswitchestheproteinoffProteinkinase2isactivatedbyproteinkinase1.Onceactivated,proteinkinase2phosphorylatesproteinkinase3,activatingtheenzyme.Proteinkinase3thenphosphorylatesatranscriptionfactor,increasingitsaffinityforasiteontheDNA.BindingofatranscriptionfactortotheDNAaffectsthetranscriptionofthegeneinquestion.Eachoftheseactivationstepsinthepathwayisreversedbyaphosphatase.FromGeraldKarp,CellandMolecularBiology-conceptsandexperiments(6thedition)SignaltransductionpathwayconsistingofproteinkinasesandproteinphosphatasesFromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition)GTPase-activatingproteins(GAPs)inactivatetheproteinbystimulatingittohydrolyzeitsboundGTPtoGDP.Guaninenucleotideexchangefactors(GEFs)activatetheinactiveproteinbystimulatingittoreleaseitsGDP;NotethattheconcentrationofGTPincytosolis10timesgreaterthantheconcentrationofGDP,theproteinrapidlybindsGTPonceitejectsGDPandistherebyactivatedTheregulationofamonomericGTPases.186SecondMessenger第一信使：細胞外部信號。第二信使：由細胞表面受體轉換而來的細胞內部信號。第一信使同其膜受體結合后最早在胞膜內側或胞漿中出現的僅在細胞內部起作用的信號分子；能啟動或調解細胞內稍晚出現的細胞應答。187SignalTransductionataGlance188TypesofReceptor-EffectorLinkage189TransductionSignalmoleculesrecognition(receptor)ReactionExtracellularsignalscanactslowlyorrapidlyFromEssentialCellBiology(?GarlandScience2010)191SignalCascadeTwodifferenttypesofsignaltransductionpathways:oneinwhichasignalingpathwayisactivatedbyadiffusiblesecondmessengerandanotherinwhichasignalingpathwayisactivatedbyrecruitmentofproteinstotheplasmamembrane.Mostsignaltransductionpathwaysinvolveacombinationofthesemechanisms.signalingpathwaysarenottypicallylineartracksasdepictedhere,butarebranchedandinterconnectedtoformacomplexweb.FromGeraldKarp,CellandMolecularBiology-conceptsandexperiments(6thedition)TheBasicCellSignalingProcess1935.2

GProtein-coupledReceptor

2006NatureReviewDrugDiscoveryGPCRTrulyuniquedrugs：~1,300Smallmolecules：~1,200Majordrugtargets：~300Drugtargetsinhuman：2664majortypesofdrugtargets：GPCRs，nuclearreceptors，ligand-gatedorvoltage-gatedionchannelsGPCR：>60GPCR－最具潛力的藥靶2006全球銷量前10名的藥物排行藥名2006年銷售額(USD

百萬)公司疾病主要靶點批準上市日期1Lipitor14,385Pfizer高血脂HMG-CoA還原酶Dec-962Advair,Seretide6,129GSK哮喘糖皮質激素受體/腎上腺素受體Aug-003Plavix,Iscover6,057Bristol-MyersSquibb/Sanofi-Aventis血栓P2Y12受體Nov-974Nexium5,182AstraZeneca腸胃潰瘍質子泵抑制劑Mar-005Norvasc4,866Pfizer高血壓鈣離子通道Jul-926Remicade4,428Johnson&Johnson,Schering-Plough,MitsubishiTanabePharma自免疫性腸炎及類風濕性關節炎TNFα抗體Aug-987Enbrel4,379Wyeth類風濕性關節炎TNFαNov-988Zyprexa4,364EliLillyandCompany精神病多種GPCR,包括D1,D2,5HT2A,5HT2C等Sep-969Diovan4,223Novartis高血壓血管緊張素受體AT1RDec-9610Risperdal4,183Johnson&Johnson精神病多種GPCR,包括5HT1A,5HT1,5HT2A,5HT2C，5HT7，D1,D2,等Dec-93196

G-蛋白:◆組成:一般由三個亞基組成,分別叫α、β、γ,β、γ兩亞基通常緊密結合在一起,只有在蛋白變性時才分開