基礎生物學技術實驗141140003曹志凡B3常帥，樂子薇，杜天明2014.11.19還原糖及蛋白質的鑒定曹志凡141140003實驗目的初步掌握鑒定可溶性還原糖與蛋白質的方法；學習使用碘液做指示劑判斷淀粉是否水解完全。了解有關酶的特性了解常見生化組分鑒定的方法與意義。實驗原理淀粉在α-淀粉酶作用下會發生水解，利用碘液與淀粉結合會顯藍色，可以判斷淀粉有沒有水解完全。α-淀粉酶的最適溫度大致在60攝氏度附近，故淀粉的分解在水浴鍋中進行。本尼迪特試劑是斐林溶液的改良試劑，它與醛或醛（酮）糖反應也生成Cu2O磚紅色沉淀。它是由硫酸銅、檸檬酸鈉和無水碳酸鈉配置成的藍色溶液，可以存放備用，避免斐林溶液必須現配現用的缺點，可以用此試劑來鑒定還原糖，在加熱時可發生反應。茚三酮是一個有機化合物，被廣泛用于檢測氨、一級和二級胺，尤其是氨基酸。氨基酸與茚三酮水合物在弱酸條件下共加熱時，氨基酸被氧化脫氨、脫羧，而茚三酮水合物被還原，其還原物可與氨基酸加熱分解產生的氨結合，再與另一分子茚三酮縮合成為藍紫色化合物，稱為羅曼紫。蛋白質中也含有氨基，可以與茚三酮發生顯色反應。雙縮脲試劑A的成分是氫氧化鈉的質量分數為0.1g/mL的水溶液；雙縮脲試劑B的成分是硫酸銅的質量分數為0.01g/mL的水溶液。雙縮脲試劑可以驗證蛋白質的存在，試劑A加入給反應創造了一個堿性環境，使反應順利進行。實驗的試劑與器材1.實驗試劑：淀粉水溶液，碘液，葡萄糖溶液，蔗糖溶液，本尼迪特試劑，α-淀粉酶，標準蛋白溶液，鮮牛奶，雞蛋清2.實驗器材：滴管，反應所需的試管，恒溫水浴鍋，試管夾，試管架，量筒，白色滴板，電爐實驗步驟淀粉的水解在白色滴板的空穴內各加5-6滴稀碘液，先用滴管取數滴2%的可溶性淀粉溶液于一盛有稀碘液的滴孔內，觀察顏色變化在試管內加入5ml2%的可溶性淀粉溶液和2ml0.02mol/L、PH=6磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，在60攝氏度恒溫水浴中預熱5min，加入上述配置好的α-淀粉酶酶液0.5ml,不斷攪拌，每隔1分鐘用滴管取數滴盛于稀碘液的滴板孔內，觀察其顏色變化。（2）還原糖的鑒定1.取上述反應液三滴于一支試管中，然后加入本尼迪特試劑2ml，置于沸水浴中加熱數分鐘，取出，冷卻，觀察實驗結果。2.另取一支試管，加入1％葡萄糖溶液1ml，然后加入本尼迪特試劑2ml，置于沸水浴中加熱數分鐘，取出，冷卻，觀察實驗結果。3.另取一支試管，加入1％蔗糖溶液1ml，然后加入本尼迪特試劑2ml，置于沸水浴中加熱數分鐘，取出，冷卻，觀察實驗結果。（3）蛋白質雙縮脲實驗：1.取一支試管，加入標準蛋白質溶液十滴，再加入10%NaOH溶液十滴及1%硫酸銅溶液兩滴，混勻，觀察是否出現紫玫瑰色。2.用鮮牛奶與雞蛋清重復上述步驟（4）蛋白質茚三酮反應：1.取1ml蛋白質溶液于試管中，加入8-10滴茚三酮試劑，加熱至沸騰，觀察是否出現藍紫色（此反應需在PH5-7下進行）。2.用鮮牛奶與雞蛋清重復上述步驟。五．實驗結果1.淀粉水解過程中，每隔一段時間取樣加入碘液觀察，可以看到藍紫色逐漸變淺，最終變為碘液的黃色，說明淀粉逐漸水解，最終完全水解。2.在加入本尼迪特試劑和沸水浴后可以觀察到三只試管中只有盛有蔗糖試劑的試管仍呈藍色，其余兩支均有磚紅色沉淀生成。3.用雙縮脲試劑處理后，三只試管均出現了紫玫瑰色。4.茚三酮試劑處理后，三只試管均出現了藍紫色。（右三只試管為還原糖鑒定時的實驗現象，中間為蔗糖溶液，右一為葡萄糖溶液，左一為淀粉水解后的溶液，中間三只試管為蛋白質雙縮脲實驗時的現象，左一為雞蛋清，中間為牛奶，右一為標準蛋白，左三只為蛋白質茚三酮實驗時的現象左一為雞蛋清，中間為牛奶，右一為標準蛋白）實驗結論本尼迪特試劑是含有銅離子的堿性溶液，能使自由醛基或者酮基的糖氧化，其本身還原成紅色或黃色的氧化亞銅，此法常用于還原糖的定性與定量測量，蔗糖具備還原性，故無法顯色。α-淀粉酶能將淀粉分子鏈中α-1,4-葡萄糖苷鍵切斷，使淀粉成為長短不一的短鏈糊精以及少量麥芽糖和葡萄糖，因此酶反應過程中，淀粉對碘液呈藍色的反應逐漸減弱。茚三酮反應即：所有氨基酸及具有游離α-氨基和α-羧基的肽與茚三酮反應都產生藍紫色物質，只有脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應產生（亮）黃色物質。茚三酮反應此反應十分靈敏，根據反應所生成的藍紫色的深淺，用分光光度計在570nm波長下進行比色就可測定樣品中氨基酸的含量（在一定濃度范圍內，顯色溶液的吸光率與氨基酸的含量成正比），也可以在分離氨基酸時作為顯色劑對氨基酸進行定性或定量分析。雙縮脲試劑是一個用于鑒定蛋白質的分析化學試劑，當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。問題解答本尼迪特試劑、雙縮脲試劑，和α-淀粉酶的各自配置方法。本尼迪特試劑：稱取85g檸檬酸鈉及五十克無水碳酸鈉，溶于400ml蒸餾水中，另溶解8.5克硫酸銅于50ml熱水中，將硫酸銅溶液緩緩加入檸檬酸鈉-碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌，如有沉淀可過濾。α-淀粉酶溶液：稱取酶粉10-15mg，用0.02mol/LPH=6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液溶解，然后定容到50ml備用.雙縮脲試劑：A液：10gNaOH溶于水，然后稀釋至100ml,B液：1g硫酸銅溶于水，稀釋至100ml。茚三酮如何用于脯氨酸含量的測定?答：當用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸的含量的高低。在520nm的波長下比色，從標準曲線（用脯氨酸標準溶液制得）上查出(或用回歸方程計算)脯氨酸的含量。

3.雙縮脲反應的實質。答：紫色絡合物分子結構式在堿性溶液（NaOH）中，雙縮脲（H2NOC－NH－CONH2）能與銅離子（Cu2+）作用，形成紫色絡合物（該物質的分子結構式見圖），該反應即雙縮脲反應，任何蛋白質或者蛋白質水解中間產物都有雙縮脲反應。這個性質顯示和蛋白質分子中所含肽鍵數目有一定的關系。肽鍵數目越多，顏色越深。本尼迪特試劑與還原糖反應實質。檸檬酸鈉和碳酸鈉均為強堿弱酸鹽，在水中它們均