臨床熒光PCR標本采集、運送、保存及處理中國人民解放軍第三0二醫院王海濱一、臨床常遇到的標本類型血清（漿）、全血、外周血單個核細胞、痰（檢測結核、HBV等）、棉拭子（咽拭子或肛拭子，如H1N1、H7N9）、膿液、體液（胸、腹水，精液，引導分泌物等）、乳汁（處理）、組織細胞（定量的相對性、HPV取樣）。二、標本采集標本采集時間對PCR檢測結果的影響：需早晨空腹采集，早上血液里面的成分比較穩定。下午采集的標本不能反應病人機體的基礎狀況。標本的類型和采集量：標本量需依據檢驗方法的差異，如羅氏COBAS方法，需要的標本量是血漿1ml。采樣質量的評價：與其他檢查項目相同，輸液部位抽血的錯誤做法等。采樣及運輸容器：關于低溫保存的誤區，夏季異地運輸需冷運。標本間的交叉污染：交叉污染對生化檢測影響不大，但對免疫或分子的檢測影響比較大。樣本一經采集，則應盡可能快的送至檢測實驗室。對臨床檢驗使用的樣本，原則上不需要加任何防腐劑或穩定劑。所加入的任何物質均有可能成為PCR的干擾物質。特別是一些質控品。實驗室應根據待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運送條件作出相應的規定。低溫保存和運輸對RNA的檢測似有必要。凍干質控樣品更穩定，易于保存運輸。（一）血清（漿）無論是血漿還是血清，采集后盡可能做到及時離心使細胞分離。血液采集后室溫放置半小時，血液凝固后就可以分離血清。進行不同的檢測時，血清或血漿需要保存的溫度不同：DNA測定：血清或血漿分離后封閉保存在2-8度，長期穩定。但要避免溶血引起的干擾。RNA測定：血清或血漿分離后封閉保存在2-8℃，一個月內基本穩定。但要避免溶血引起的干擾。以上標本長期保存盡可能在-20℃下，反復凍熔對結果影響不大。有文獻提出，檢測HIV的標本，需在-70℃長期保存，但沒有條件的單位未必非要求保存在-70℃。1.標本和核酸不同保存條件穩定性實驗PPT6顯示的是標本和核酸在不同保存條件下穩定性的實驗，分為兩組，一組是標本，另一組是純化后的核酸。1）血清標本的保存條件：室溫、冷藏、冷凍、-70°C。大家可以看到，在室溫條件下，血清標本第一天和第七天，檢測結果沒有明顯的變化，第十四天開始下降，第二十一天已完全降解。4°C保存，及冷藏、冷凍保存并反復凍融的血清標本，可以保存28天。2）純化后的核酸保存條件：室溫、冷藏、冷凍、-70°C。提取后的核酸，放在室溫、冷藏、冷凍甚至是-70°C。這里把室溫、冷藏、還有反復凍融這三個數據拿來比較，可以看到，一個月之內結果的穩定性，三者是重合的。2.全血（或PBMC）細胞（細胞內病毒）核酸提取以全血作為待測標本時，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉，不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測，可4℃下短期保存，如用于RNA檢測，則應在取血后，盡快提取RNA。外周血單個核細胞的分離：1）使用淋巴細胞分離液分離制備；2）使用紅細胞裂解液（冰水），裂解全血中的紅細胞，經生理鹽水洗滌，即可得到單個核細胞。外周血單個核細胞如暫不提取核酸，可保存于-20℃下。（二）痰痰屬于分泌物，臨床上常用作為結核桿菌DNA測定標本。痰標本中含有大量粘蛋白和雜質，故在核酸提取時，需對樣本進行初步處理，即用1mol/LNaOH或變性劑液化。如用于非結核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測，痰標本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化標本如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃。痰標本處理通用模式：（1）通用標本處理（Universalsampleprocessing，USP）溶液：4-6mol/L鹽酸胍（GuHCl）；50mmol/LTris-HCl，pH7.5；25mmol/LEDTA；0.5%Sarkosyl；0.1~0.2mol/Lβ-巰基乙醇。（2）0.05%Tween80。（3）10%Chelex-100(含0.03%TritonX-100和0.3%Tween20)。（三）棉拭子在使用PCR方法檢測性病病原體時，臨床標本一般為棉拭子，如咽拭子、肛拭子。可將棉拭子置于適量生理鹽水中，充分震蕩洗滌后，室溫靜置5～10分鐘，待大塊狀物下沉后，取上清立即離心，其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取，則需保存于-20℃下。標本采集質量和處理質量對檢測結果有一定的影響，盡可能采集深部的標本，而且放入含有培養液的試管中，需混勻。（四）體液臨床體液標本包括胸水，腹水，腦脊液，尿液等，可按水樣標本的方式離心取沉淀后，提取核酸。與血清和血漿相同。沉淀樣本的保存同上。（五）膿液膿液的處理依情況而定，如用于分枝桿菌(如結核桿菌)核酸測定的標本，粘稠的膿液可采用痰標本的處理模式，先進行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心可用于DNA提取。直接堿性裂解法。對于用于非分枝桿菌測定的膿液標本，如過于粘稠，則加入適量生理鹽水，充分振蕩后，靜置，取上清立即離心，沉淀用于DNA提取；如為水樣，則按上述直接離心取沉淀即可。（六）乳汁乳汁有時也可作為標本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、結核分枝桿菌和布魯氏菌等的PCR檢測。離心后上層是蛋白脂肪項，下層是水相，需取水相檢測目標核酸。三、臨床標本中PCR反應干擾物內源性的：免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產物、白細胞內的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。外源性的：如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過度UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標本容器或采樣器材上含有的抑制物。常見PCR干擾物質:（一）肝素抑制的機制肝素對MLV逆轉錄酶和TaqDNA聚合酶均很強的抑制作用，如果臨床標本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中，標本中的肝素可結合于DNA和RNA上從而影響后續的熒光PCR擴增。對標本進行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用。肝素的抑制試驗：每μg核酸標本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性。在標本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸(于5mMTrispH7.5，1mMCaCl2，40URNasin25℃2小時)可去除肝素的抑制作用。（二）血紅蛋白、乳鐵蛋白（lactoferrin）抑制機制可能是：1.與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中有關。研究鐵的抑制效應時，發現其干擾DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是PCR抑制物。2.亞鐵血紅素(Heme)可通過返饋抑制調節DNA聚合酶活性及協調紅細胞內血紅蛋白成分的合成。也觀察到，氯化高鐵血紅素通過直接作用于DNA聚合酶，與成為一個與靶DNA競爭的抑制劑和核苷酸的非競爭性抑制劑。3.由于靶核酸DNA被血液中大量的凝血有機物質包裹所致，使得靶DNA不能接觸DNA聚合酶。（三）去除或減輕抑制的一些方法1.NaOH處理可中和臨床標本中的TaqDNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適用于DNA含量低的標本，因為NaOH處理可使DNA大量丟失。2.加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液對TaqDNA聚合酶的抑制效應，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功擴增，而通常血液含量只能是0.2%。3.BSA也可增加rTth或TaqDNA聚合酶的擴增能力，使其對糞便和肉類標本中抑制物的抵抗能力分別提高10和20倍。4.單鏈DNA結合T4基因32蛋白（gp32）有類似BSA的增強效應。四、核酸提取的改良方法（一）以前的核酸提取方法旋轉離心柱（SPINCOLUMN）方法、玻璃粉吸附法、二氧化硅（Se）或硅藻吸附法。（二）最近發展的方法微量全血核酸提取法：NaI方法；其它方法：疏水性Immobilon-P膜、全自動核酸純化儀；一步法（一管法）、血清直接加入法等；磁珠純化法。肝炎病毒感染與免疫學檢驗中國人民解放軍第三〇二醫院王海濱

一、傳播途徑與病程臨床上病毒性傳染病分為兩類：急性病毒性感染：急病毒感染又稱為自限性病毒感染，短的是半個月，長一點是一個月或者兩個月，很快就徹底把病毒清除掉，獲得比較強的免疫功能，有的是終身免疫。慢病毒感染：慢病毒感染病毒感染以后，病毒會在人體內的細胞里面進行傳代、復制、進行不同病毒的傳代，導致疾病反復的進行發作。我們總結發現，急病毒感染和慢病毒感染與傳播途徑有密切關系。（一）血液傳播途徑的特點通過血液傳播途徑的傳染病，都是慢病毒感染，比如說乙肝、丙肝、愛滋病等，都是很容易慢性化的疾病，稱為慢病毒感染。（二）消化道傳播通過消化道傳播，或者呼吸道傳播的傳染病，常常是急性病毒感染，感染以后，可在有效的時間內清除病毒，最常見的是甲肝及戊肝。（三）其他途徑的傳染病（呼吸道傳播）呼吸道傳播途徑，最常見的是流感，還有SARS、甲型H1N1，HN9等，從呼吸道傳播，入侵的細胞主要是上皮粘膜細胞，因此病毒很難進行長系列的傳代。二、肝炎病毒感染的病程發展（一）感染過程HBV(HCV)常由血液傳播進入體內，經過非特異性免疫清除（特異性抗HBs、補體、吞噬細胞等），突破循環清除途徑的HBV等進入肝臟、接近肝細胞，進入肝細胞（受體、配體結合），并在肝細胞內復制。（二）感染的條件攝入數量需>10000IU/ml以上，且病毒具有一定的活性。（三）急性肝炎免疫清除感染宿主免疫系統對入侵HBV復制的免疫識別程度（免疫反應強度適度）、免疫清除功能和代謝功能正常等，急性肝炎和重型肝炎的快速清除，無HBV復制肝細胞的殘留。（四）急性感染期如免疫反應功能低下——慢性肝炎機體產生免疫損傷和代謝平衡。（五）病原攜帶狀態（母嬰傳播）病毒與免疫耐受，長期慢性炎癥致肝硬化、肝癌。（六）重型肝炎HBV或HCV復制產生抗原，誘導機體免疫系統發生針對肝細胞的免疫殺傷、聯合炎癥。ALT、CHE、TBIL等動態變化。病毒學指標變化及預后（細胞內病毒和抗體產生的速度與量）。（七）肝纖維化反復肝臟炎癥、纖維細胞增生或肝細胞再生，HA（代謝指標）,PIIIP,IV.C和LN（板層素，壓力指標），質地變硬，肝內脈管系統壓力增加，缺血缺氧聯合病毒活動性復制帶來的免疫損傷，不對稱結構增生。（八）肝硬化，反復炎性變的結局肝硬化，病理診斷，假小葉的形成，供血血管（肝動脈、門脈），回流管（膽管、肝靜脈），直接后果：缺血和缺養。代謝障礙和代謝產物積聚。（九）肝癌眾多指標的選擇，關于腫瘤標記物的價值。（十）酒精性肝硬化肝移植可能是最后的方法。（十一）脂肪肝能量吸收的不均衡性。三、肝炎病毒感染后生化指標的變化及意義（一）肝功能指標分類1.肝功能指標反映肝細胞蛋白合成代謝功能的指標：白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、膽堿酯酶(CHE)、凝血酶原活動度(PTA)。由于它們都是由肝臟合成的，一旦肝臟合成功能下降，以上指標在血液中含量或活性隨之下降，其降低程度與肝臟合成功能損害程度呈正相關。2.肝細胞受損及嚴重程度指標：谷丙轉氨酶ALT、谷草轉氨酶AST、腺苷脫氨酶(ADA)、膽堿酯酶(CHE)、乳酸脫氫酶(LDH)等，以正常值2倍為界。以上各項酶在肝細胞中均有存在，當肝細胞膜受損或細胞壞死時，這些酶在血液中升高。通過測定血清或血漿中酶的活性，即可反映肝細胞受損情況及損傷程度。3.特異與非特異的鑒別：肝臟功能的非特異性因素，自身免疫、藥物、運動、發燒、飲酒、脂肪肝，EBV/CMV感染（非肝炎類病毒）（二）細胞損傷與酶代謝功能的關系1.肝膽代謝（排泄）、分泌及解毒功能的指標：總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽酸(TBA)、血氨(NH3)。肝細胞損害時，其排泄、分泌、運輸及解毒功能出現障礙，造成血液中TBIL、DBIL、TBA和NH3濃度升高。2.診斷膽汁淤積指示酶(包括同工酶)有幫助的酶指標：堿性磷酸酶(ALP);r谷氨酸轉肽酶(GGT)、5′-核苷酸酶(5′-NT)等，以ALP及γ-GT應用較多。這些酶在肝內膽管上皮層的濃度較高。當上皮層受損及膽管內壓力增高時，便有這些酶增多進入血液。3.肝臟間質成分增生(肝纖維化和肝硬化)的指標：膠原或其末端多肽-Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢP)、Ⅲ型原膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原C端原肽(Ⅳ/PC);糖蛋白-層黏蛋白(LN);蛋白聚糖-透明質酸(HA)。四、肝炎病毒感染過程的免疫學指標免疫學指標目前是臨床檢驗的重點，病毒從外界侵入到人的肝細胞，通過一系列的復制、繁殖等會發生免疫反應和免疫應答，對乙肝來說，有乙肝兩對半、乙肝五項、或者六項等。病毒侵犯肝細胞以后，進行復制，首先要復制核酸成分，然后HBaAg編碼核心抗原，核心抗原包括HBaAg，因為核心抗原像衣服一樣包上去，多余剪掉，剪下來的就是Hbe抗原，Hbe抗原實際上是乙肝病毒復制的直接標志。（一）乙肝（HCV/HIV等）血清抗原抗體檢測方法乙肝表面抗原抗體，或者復制過程中，這些抗原抗體檢測的方法有多種：1.ELISA法：過去我國常用ELISA方法：酶聯免疫吸附試驗、敏感性和重復性差，而且受季節的影響比較大，因此這幾年慢慢地被淘汰了。2.時間分辨法：用稀土熒光材料替代HRP等酶類標記抗原或抗體，敏感性好于ELISA法，缺陷同ELSIA法。3.金標快檢條：愛康HBV，韓國SD公司生產的HIV1/2；其他不合格者多。4.化學發光法：磁珠介導的熒光標記、實現自動化，羅氏和雅培等公司應用較多，現已有國產。（二）乙肝五項組合類型及臨床意義1.血清HBVDNA：HBV復制的標志，其動態變化可判斷是清除過程還是持續復制過程。2.肝細胞內HBV與cccDNA：病毒存在的證據，病毒在復制（復發）的根源。3.乙肝五項與血清HBVDNA的組合模式1）大三陽：HBsAg(+),抗HBs,HBeAg(+),抗HBe，抗HBc(+)；HBVDNA(+)HBsAg(+),抗HBs(+)，HBeAg(+),抗HBe，抗HBc(+)；HBVDNA(+)HBsAg(+),抗HBs，HBeAg(+),抗HBe，抗HBc；HBVDNA(+)HBsAg(+),抗HBs，HBeAg(+),抗HBe，抗HBc(+)；HBVDNAHBsAg,抗HBs，HBeAg(+),抗HBe，抗HBc(+)；HBVDNA(+)HBsAg(+),抗HBs(+)，HBeAg(+)，抗HBe(+)，抗HBc(+)；HBVDNA(+)2）小三陽：HBsAg(+)，抗HBs，HBeAg，抗HBe(+)，抗HBc(+)；HBVDNAHBsAg(+)，抗HBs，HBeAg，抗HBe(+)，抗HBc(+)；HBVDNA(+)HBsAg(+)，抗HBs(+)，HBeAg，抗HBe(+)，抗HBc(+)；HBVDNAHBsAg(+)，抗HBs(+)，HBeAg，抗HBe(+)，抗HBc(+)；HBVDNA(+)3）“一、五”陽及轉歸（核苷類似物治療）HBsAg(+)，抗HBs，HBeAg，抗HBe，抗HBc(+)；HBVDNAHBsAg(+)，抗HBs，HBeAg，抗HBe，抗HBc(+)；HBVDNA(+)（三）HBV/HCV病毒核酸檢測1.HBVDNA定量：一步法、層析柱法、磁珠法（手工和COBAS法）。2.試劑質量評估：國產試劑和進口的試劑存在差異，特別是國產試劑模仿的比較多，但是創新比較少，規范相對差。3.YMDD變異：對乙肝的檢測還有YMDD變異，如拉米夫定治療以后，發生的病毒的變異，這時YMDD檢測的方法有很多，有測序方法，有熒光的方法。4.阿德福韋、恩替卡韋、雷米替丁等變異：實時熒光的檢測，也可以用測序的方法，因為這些抗病毒的藥都可以誘導以前的藥。5.前C變異：G1896A，實時熒光或測序法6.HBV基因分型：B型和C型為主，B/C混合型較少，雙色實時熒光或測序法7.HCV基因分型：I型和II型為主，I/II混合型較少，III型和VI型，熒光或測序法還有前C變異，一般G1896A、實時熒光的方法和測序的方法來做。（四）HIV/EBV/CMV/TB/EV71等病毒核酸檢測1.HIVRNA定量：層析柱法、磁珠法（國產和COBAS法）。2.HIV變異和分型：與抗病毒治療關系較大。3.EBVDNA：傳染性單核細胞增多癥、鼻咽癌高發；不明原因肝損害。白細胞。4.CMVDNA：巨細胞病毒，尿中病毒含量高于血清，試劑質量評價，兒童尿！5.TBDNA：痰液檢測意義的局限性。隱匿性感染病例的增多，胸透與治療。6.EV71RNA：手足口病毒感染的診斷指標，檢測的質量控制。7.HPVDNA：人乳頭瘤病毒分型和定量，檢測的質量控制。五、關于肝炎的治療（一）HBV抗病毒關于肝炎的治療，實際上爭議很多，在西方國家，不論乙肝還是丙肝，治療不采用保肝，只抗病毒。保肝有好處和壞處，保肝時，本來有病毒的細胞壞死后里面的病毒會釋放出來，但是保肝后病毒又存在于細胞，導致疾病的慢性化。（二）肝移植另一個值得臨床思考的問題就是肝移植之后，同時用高效價免疫球蛋白，還有抗病毒治療，這時人體內的病毒慢慢清除。因為高效價免疫球蛋白的使用，表面抗原消失了，異抗原也伴隨消失了，還有病毒轉移了。（三）肝癌（惡性腫瘤）手術或保守治療（冬蟲夏草非常有效）。尿液分析儀的工作原理、使用和質量保證措施首都醫科大學附屬北京安貞醫院左大鵬

一、多聯試紙條的結構和功能（ppt4）這是一張我們在日常工作中尿液檢查的一個試紙條，它上面大概有十個檢查項目。這十個檢查項目在試紙條的外包裝盒上都有注明。比如白細胞，亞硝酸鹽，尿膽原，蛋白質，酸堿度，隱血，尿比重，酮體，膽紅素，葡萄糖。有的生產企業還開發出尿十一項檢測，所增加的這一項是來測定尿中維生素C的含量。（ppt6）尿干液化學的試紙條大概一共有十個到十一個模塊，每一個模塊的結構就像我們圖中所展示的這樣子，這個圓圈里面所代表的是其中一個模塊，它大概分為幾個層。（ppt7-8）第一層尼龍膜起保護作用，尼龍膜可以把一些雜質、灰塵濾過掉，防止大分子物質對反應的污染；第二層絨制層包括碘酸鹽層和試劑層，前者可破壞維生素C等干擾物質，因為大量的維生素C對尿糖，尿溢血，尿的膽紅素和尿亞硝酸鹽實驗會產生負干擾。后者含有各種化學物質，能與尿液中待查的物質起化學反應，產生顏色變化；第三層吸水層，能防止尿液滲到相鄰的檢測區，影響其他模塊；最后一層選取尿液不浸潤的塑料片作為支持物。尿液浸透了試紙條之后，它就會在相應的模塊上產生反應。試紙條圓筒外面會有一些標示，不同的顏色代表的是陽性，陰性，幾個加號的陽性。這是一個工作人員拿著一個浸泡尿液之后的試紙條和包裝盒上各個檢測項顏色進行對比。當然我們現在使用更多的是尿液自動分析儀，就是我們將試紙條浸泡尿液之后，放在儀器上進行檢測。二、尿液自動分析儀的應用（一）尿液分析儀的工作原理我們使了一個尿液分析儀，這個尿液中相應的化學成分使尿多聯試紙帶上得各種含特殊試劑的模塊發生了顏色的改變。顏色的深淺與尿液中的相應的物質的濃度成正比。我們將多聯試紙帶置于尿液分析儀的比色進樣槽上，各模塊依次受到儀器光照射后產生不同的反射光，儀器接收不同強度的光信號將其轉換為相應的電訊號，然后再經過微機處理，利用一定的公式，計算出各個項目的反射率，然后跟標準曲線進行比較，標準曲線是廠家在研制生產劑之前做好的，把標準曲線的數據直接輸入計算機中即可。跟標準曲線進行比較后我們可以得出一個測定值。然后儀器就以一種定性、半定量的形式打出報告，這個大家都很熟悉。（二）尿液分析儀的組成尿液自動分析儀由機械系統、光學系統和電路系統三部分組成。1、機械系統機械部分主要功能是將待測的試紙條傳送到位，再將檢測后的試紙條排進廢物盒。它的工作模式有齒輪傳送，膠帶傳送，機械臂傳送等。全自動的尿液分析儀它還有自動的進樣裝置。（ppt13）我們看這個圖實際上是一個機械裝置的進樣，這是擱試紙條的一個樣品臺，機器可以伸進去。這是光學系統，這是電路，把光的信號轉化成電的信號，經過微機處理。這是一個基本的結構圖。也就是說一個尿液分析儀具備有機械系統，光學系統和電學系統三個部分。2、光學系統光學系統通常包括光源、單色處理和光電轉換三部分。光線照射到反應區的表面產生反射光，反射光的強度與各個項目的反應顏色成反比。不同強度的反射光再經光電轉換器轉換為電信號進行處理。（ppt15）我們再來看一下這個圖，這是光源，光會照射在這個模塊，模塊產生顏色的深淺取決于它的濃度，濃度越多，含量越多，越深。光照在上面之后，一部分光被吸收，一部分光就被反射出去，我們叫反射光。反射光通過一個接收器接收。接收之后，再通過光電轉換器把光信號變成電信號。這屬于光學系統。尿液分析儀的光學系統有發光二極管，濾光片分光系統和電荷耦合器件系統，叫CCD。（1）、發光二極管（LED）系統采用可發射特定波長的發光二極管作為檢測光源。兩個檢測頭上有三個不同波長的發光二極管，對應于試紙條上特定的檢查項目，分別有紅的，波長是660nm；橙色的，620nm；綠色的，555nm。它們對應的檢測面是60度角，照在這個模塊上。作為光電轉換器的這個光電二極管是垂直接收的，因為它反射光垂直向上反射。在檢測光照的同時，接收反射光。由于距反射區很近，所以它不需要光路進行傳導，所以沒有信號的衰減。（2）、濾光片分光系統濾光片的分光系統采用了高亮度的鹵鎢燈作為光源，這是另外一種發光的系統。經過光導纖維傳到兩個檢測頭，每個檢測頭有十一個檢測位置，包括一個空白補償的位置，也是以45度的角照在模塊的上方，然后在模塊的正上方也有一組光纖，反射光被傳導到濾光片的輪處分光。它有一個范圍，分十個波長，從510nm—690nm，然后單色光的光信號經過光電二極管轉換成電信號。這是兩個不同的檢測系統，一個是用發光二極管，一個是鹵鎢燈濾光片分光系統，當然這種儀器比較貴，單純的發光二極管儀器比較便宜。（3）、電荷耦合器件系統電荷耦合器件系統以高壓燈作為光源，采取電耦合器技術進行光電轉換。它把反射光分為赤色（610nm），綠色（540nm），和青色（460nm）三種原色。又將三種原色中的每種顏色細分為2592種色素，這樣整個反射光就可以分為7776種色素，這樣它分的就更準確了。這種電荷耦合器件（CCD）的基本元件是由金屬，氧化物，半導體組成的。它的突出特點是以電荷為信號，而不同于其他的部件是以電流和電壓為信號。當光照射到CCD硅片上的時候，在柵極附近的半導體會產生電子空穴，多數載流子被柵極電壓排開，少數的被吸收，形成一個纖毫電荷，將一定的電壓加在上面，然后再把光信號變成電信號。這種器件有良好的光電轉換性能，光電轉換因子達到99.7%，光譜的響應范圍也很寬，可以從可見光到近紅外光都可以檢測。3、電路系統電路系統是將轉換后的電信號放大，經過一個中央數據處理器（CPU），和我們當初輸進去標準的曲線對照，最后打出一個報告。這是通過一個軟件來實現的。（三）尿液分析儀的檢測原理實際上尿液分析儀的檢測本質是對光的吸收和反射，模塊產生顏色的深淺對光的吸收反射是不一樣的。顏色越深，吸收光越多，反射光就越少，反射率就越低；反之如果說顏色比較淺，吸收光就比較少，反射光就比較大，反射率就比較大。換句話說，光線照在不同的模塊上產生的反射光的強度跟它的顏色成反比，而顏色和它的含量成正比。反射率計算公式：R（％）=Tm×Cs/Ts×Cm×100％Tm：試劑塊對測定波長的反射強度；Ts：試劑塊對參考波長的反射強度；Cm：標準塊對測定波長的反射強度；Cs：標準塊對參考波長的反射強度。不同強度的反射光再經光電轉換器轉換為電信號進行處理。然后電路系統將轉換后的電信號放大，經模／數轉換后送到CPU處理，計算出最終檢測結果，然后將結果輸出到屏幕顯示并送打印機打印出報告。其中CPU不僅負責檢測數據的處理，還控制整個儀器機械、光學系統的運作，并通過軟件實現多功能操作。（四）尿液自動化檢查的質量控制在常規檢驗中，雖然尿液分析儀的使用不受人為因素的影響，但尿液標本的質量，儀器和試紙條的質量，試紙條的效期和儀器是否定期校準都會給自動化分析帶來失控。分析中質量控制是保證檢驗質量的重要措施，操作步驟的標準化是目前臨床檢驗工作一個急需解決的問題。1、尿液標本的收集及保存標本新鮮對尿液自動化分析至關重要。我們要搜集新鮮尿，所謂新鮮尿就是剛排除尿到我們檢測的時間最好不要超過一小時。收集尿液容器要干凈，最好是一次性尿杯，尿液不能被其他分泌物或環境中微生物及雜質污染以保證檢驗的準確性。在流尿的時候，特別是女病人在流尿的時候，不要被陰道分泌物污染。所以我們一般的都主張就是男性女性，我們都流中段尿。開始的尿不要，留中間尿進行化驗。2、堅持每日室內質控（1）質控物的選擇：多數采用人工尿液加入標準物作為質控物。實踐證明：對于尿糖、尿蛋白、血紅蛋白和白細胞基本能滿足要求；但對于尿膽紅素、尿膽原就不甚滿意，配制后不能久放等原因，所以有的學者采用濃縮尿質控物，能得到較好效果。（2）質控步驟：首先應將質控物放入室溫，使其溫度與室溫一致，否則會因溫度影響使部分結果偏低。每次必須使用“正常”和“異常”兩種濃度的質控物進行試驗；一天內最好使用同一份質控標本。（3）結果分析：如果質控物的“正常”結果變成“異常”結果或“異常”結果變成“正常”結果，均為失控。或者質控物某一模塊的測定結果超過靶值正負1個加號和等級，即±2個加號以上（含±2個加號）也為失控。3、儀器性能評價和校準對新購進的儀器要進行性能評價，達到性能規定的要求后方能使用。對使用中的儀器要根據操作需要和廠家對儀器的要求定期對儀器進行校準，這是保證儀器性能的重要措施。每臺尿液分析儀在購買時，廠家都配給一條校準條，隨機攜帶，一般每半年至少應校準一次。如果發現校準不通過，應請生產廠家進行檢修和重新調試。尿干化學法人工復檢的規定。根據中華檢驗學會跟國際上的普遍要求和規定，凡是尿液干化學法檢測項目中蛋白，隱血，亞硝酸鹽和白細胞這四項化驗當中，有任何一項出現陽性結果時，都要進行人工顯微鏡的復查。這是規定，必須執行。三、尿沉渣分析儀的應用目前市場上生產的或銷售的尿沉渣分析儀有兩類，一類是基于尿沉渣顯微鏡檢查的影象分析原理，它的代表儀器就是美國戴西斯尿沉渣分析儀系統。另一個是基于流式細胞術和電阻抗檢測原理，代表就是美國Sysmex尿沉渣分析儀UF-100。這是兩類不同的尿沉渣分析儀，檢測原理是不一樣的。1、影象式尿沉渣分析儀影象式尿沉渣分析儀又稱為工作站。它的檢測原理和人工顯微鏡檢測原理是相似的，都是直觀的看看尿沉渣里面的有形成分。顯微鏡上面有一個攝像頭，然后接著一個電腦，它會對細胞形態進行分析。當然這些細胞形態的數據都已經電腦程序化了。這種方法同人工光學顯微鏡比較，它分析的量多，又比較標準，而且它的視野清楚，技術準確率也比較高，比較快。實際上仍然是把尿沉渣弄完之后，滴在玻璃片上，蓋上薄片，放在顯微鏡下，只不過剩下的程序都是用儀器代替的，用計算機來處理的。2、全自動尿沉渣分析儀全自動尿沉渣分析儀是利用流式細胞技術跟電阻抗原理來對細胞進行分析。首先它需要一個鞘流，鞘流技術要讓尿液細胞形成一個縱列的細胞流一個一個通過檢測區，檢測區里面有氬激光，用儀器檢測熒光、散射光和電阻抗的變化（ppt35）這個圖我們看一下。首先我們看這是尿液的標本，經過鞘流技術，然后尿液標本要經過染色，這些染料都是熒光染料，氬激光照射這個細胞之后，再通過流式細胞技術，根據你的熒光的情況把細胞進行分類。一個是熒光強度，一個是散射光強度。（ppt36）分類完之后就很像我們講血球分析儀，它就會有一個散點圖。不同的位置上是不同的細胞，比如說哪些位置上是紅細胞，哪些位置上是白細胞，上皮細胞，管型，細菌，結晶等。它通過熒光的強度，通過散射光的分析，可以把這些細胞打在一個散點圖上。另外細胞還可以通過電阻抗的檢測原理來檢測，電阻抗主要是通過體積大小進行分。那熒光跟散射光對細胞的大小，長度，染色的內部結構進行分析。所以有點類似于五分類血細胞分析儀的原理。（ppt37）這是一個UF100廠家的介紹圖片。這是我們的尿液，這是一個激光發射器，照在里面有不同的熒光信號。根據熒光、散射光的強度進行分類。做尿沉渣儀器分析的時候首先需要用一些染料對尿液中的有形成分進行染色。常用的染料有菲啶和羧化氰染料。這種染料的特征是反應快，結合快，背景的熒光低，細胞的熒光反而很高。細胞所發出的熒光強度和細胞染色結合程度是成正比的。（ppt39）這是一個染色后的上皮細胞，核很小，染成黃的，胞漿是藍的。當然染料不同，染的部分也不一樣。菲啶主要染色的是DNA，發射光是480nm，產生610nm橙黃色的光，可以區分有核的細胞和無核的細胞。因為它主要染DNA，DNA是細胞核。比如說紅細胞沒有核，白細胞有核。羧化氰穿透力比較強，它和細胞質結合的比較多，也是610nm的發射激光產生505nm的綠色光波。這個圖片我們顯示的就是用羧化氰激光染料染色的，胞漿都是綠色的，這個可以鑒別白細胞還有上皮細胞。熒光強度主要反映細胞的染色程度。前向熒光脈沖強度是反映細胞染色體的長度。散射光強度主要反映細胞大小。前向散射脈沖反映細胞的長度，電阻抗反映細胞的體積大小。這是些基礎參數。儀器打出的報告有定量參數，標記參數。定量參數主要包括紅細胞，白細胞，上皮細胞，管型和細菌，。標記參數包括病理管型，小圓皮細胞，類酵母菌，結晶和精子。它檢查的項目確實很多，它最后打出來的報告既有散點圖，也有直方圖。（ppt42）這是一個模式圖。你看這個散點圖，有白細胞的位置，細菌的位置，紅細胞的位置，酵母菌精子的位置，上皮細胞的位置，病理管型的位置，透明管型的位置。這些東西不會打在一個直方圖里面，根據它的散射掃描方向不一樣，打在兩個圖里面。這個圖是看白細胞、紅細胞、細菌、精子和酵母菌的。這個圖是看管型和上皮細胞的，都不一樣。這個圖是看細菌、紅細胞的，這個圖是看紅細胞、細菌、結晶的，它有幾個不同的散點圖。這是直方圖，這個直方圖主要是對紅細胞進行分析的，它可以幫我們鑒別紅細胞的形態是正常還是不正常。（ppt43）這是一個真實的報告單，報告單有標記，這地方是白細胞，這地方是紅細胞，這地方是細菌，這里面是管型，這邊是一些文字報告。報告的是每微升多少個單位，后面是它的參考值。（ppt43）這也是一個報告單，這里面可以看出這是紅細胞的直方圖還有白細胞的直方圖。四、小結尿液試紙條的結構包括尼龍膜、溶質層（由碘酸鹽層和反應層組成）、吸水層和塑料片。尿液分析儀的原理：本質是光的吸收和反射；顏色越深，吸收光量值越大，反射光量值越小，反射率越小；反射光的強度與各個項目的反應顏色成反比。定期的校準和堅持每日質控以及尿液標本的采集，這是保證尿液檢查準確可靠的重要措施。我們按照國際和國內的規定，凡是尿液干化學法檢測的蛋白，隱血，亞硝酸鹽和白細胞，這四項當中有任何一項陽性的，都要進行人工顯微鏡的復查。

尿液檢查結果分析首都醫科大學附屬北京安貞醫院左大鵬

一、蛋白尿的分析和解釋正常的腎小球濾過膜只允許小分子（20～40kD）的蛋白質通過，如溶菌酶、B2-微球蛋白、免疫球蛋白輕鏈，而中分子白蛋白（69kD）極少通過，大分子（＞90kD）的球蛋白則不能通過。近曲腎小管能將原尿的大部分小分子蛋白質重吸收，故正常尿液中蛋白質含量很低，而且一般都是遠端腎小管和髓袢升支分泌的Tamm-Horsfall蛋白和尿道組織蛋白。如果腎小管的重吸收功能受損，則尿中小分子蛋白質增多，形成所謂腎小管蛋白尿。腎小球濾過膜由腎小球毛細血管內皮細胞、基底膜和臟層上皮細胞三部分組成，形成一個包括分子屏障和電荷屏障在內的完整屏障。上述任何一種屏障遭到破壞，中分子的白蛋白，甚至大分子的球蛋白就會通過濾過膜進入尿中，形成所謂腎小球性蛋白尿。1．蛋白尿的定義和診斷標準24小時尿蛋白含量超過150mg或者每升尿液中蛋白質含量超過100mg，或者尿蛋白定性試驗呈陽性結果則為蛋白尿。2．尿蛋白的性質和來源發現患者有尿蛋白以后，首先要排除生理性蛋白尿，如發燒、劇烈運動、長時間站立等引起者；然后考慮為病理性蛋白尿。明確尿蛋白的性質和來源對鑒別診斷腎臟疾病有重要的意義。具體的檢驗手段可以做尿蛋白電泳或者分別測定尿白蛋白（Ab）、免疫球蛋白G（IgG）、b2-微球蛋白（b2-MG）、轉鐵蛋白（Tf）等的含量。尿蛋白電泳可以按照蛋白質的分子量報告尿液蛋白質的分類，即小分子蛋白質、中分子蛋白質和大分子蛋白質，然后推測具體的蛋白質種類。3．蛋白尿的分類和臨床意義根據尿蛋白的分子量和種類可按來源將蛋白尿分為：（1）腎小球性蛋白尿（glomertalarproteinuria）：是由于腎小球基底膜病變，通透性增加所致。其特點是尿液中的蛋白以白蛋白為主，病情嚴重時可出現球蛋白。各種類型的腎小球腎炎常表現為腎小球性蛋白尿。如急慢性腎小球腎炎、系統性紅斑狼瘡性腎炎、糖尿病腎病、腎小球動脈硬化等。腎小球蛋白尿又可分為選擇性蛋白尿和非選擇性蛋白尿。前者尿液中只有小分子和中分子蛋白質，后者尿液中不僅有小、中分子蛋白質，還含有大分子蛋白質。也可通過計算選擇性系數（selectiveproteinuriaindex，SPI）進行鑒別：選擇性系數（SPI）=（尿IgG/血清IgG）除以（尿Ab/血清Ab）×100％。選擇系數＜0.1，為高選擇性蛋白尿；選擇系數為0.1～0.2，為中度選擇性蛋白尿；而選擇系數為＞0.2，為非選擇性或低選擇性蛋白尿。選擇性蛋白尿和非選擇性蛋白尿的鑒別對腎臟疾病的診斷和指導治療有重要的臨床意義。在診斷方面，腎小球腎病I型為選擇性蛋白尿，而Ⅱ型為非選擇性蛋白尿。在指導治療方面，腎小球腎炎或腎病的患者如果是選擇性蛋白尿，腎上腺皮質激素治療有效；如果是非選擇性蛋白尿，則激素治療效果不好，可考慮使用免疫抑制劑治療。（2）腎小管性蛋白尿（tubularproteinuria）：是由于腎小管病變，或重吸收減少或主動分泌增多所致。其特點是以a1-微球蛋白和b2-微球蛋白為主。a1微球蛋白也是小分子蛋白質，分子量小于40kD。24小時尿蛋白定量多不超2g。間質性腎炎、腎小管疾病常表現為腎小管性蛋白尿。（3）溢出性蛋白尿（overflowproteinuria）：顧名思義是由于血漿中蛋白含量過高，從腎小球濾出后超過腎小管的重吸收能力而出現在尿液中。主要有本-周蛋白、肌紅蛋白和血紅蛋白。本-周蛋白是免疫球蛋白的輕鏈，由于漿細胞異常增殖，合成不平衡，大量輕鏈從血漿中漏出。這種蛋白質加熱60℃凝固，繼續加熱到100℃又溶解，故又稱凝溶蛋白。出現本-周蛋白是診斷多發性骨髓瘤的重要依據。肌紅蛋白尿見于肌肉損傷，如外傷、急性心肌梗死。血紅蛋白見于急性溶血，如血型不符輸血所致溶血反應。二、血尿的分析和解釋1．血尿的定義和診斷標準尿沉渣檢查，如果鏡下紅細胞數量＞3個／Hp，或者使用尿沉渣計數板定量檢查男性鏡下紅細胞數量≥4個／微升，女性≥9個／微升則診斷為血尿。2．尿紅細胞來源和分類造成血尿的疾病很多，其中包括：（1）腎臟和尿路系統疾病，這是主要和常見的原因，如腎炎和腎病、腎盂。腎炎、結石、結核、腫瘤、外傷、血管病變、多囊腎和腎下垂等。（2）全身性疾病也是造成血尿的重要原因，不要忽視，例如白血病、出血性疾病、流行性出血熱、心力衰竭、系統性紅斑狼瘡、藥物作用（比較常見的有磺胺藥、水楊酸制劑、抗凝劑和溶栓藥物）均可造成血尿。（3）尿路附近病變往往容易被誤診，如急性闌尾炎、急性和慢性盆腔炎、結腸或直腸憩室炎和腫瘤等。為了對上述疾病進行鑒別診斷就必須對尿紅細胞的來源做出回答，解決此問題的方法之一就是觀察紅細胞的形態。3．尿紅細胞形態的檢查最常用和規范的方法是采用相差顯微鏡觀察紅細胞形態。紅細胞形態觀察包括細胞大小改變，形態異常及血紅蛋白分布和含量變化。如果75％以上的紅細胞形態異常，如面包圈樣、出芽樣、頭盔樣、蘑菇樣、皺縮紅細胞、影形紅細胞（即紅細胞內血紅蛋白溢出細脆外，紅細胞只留下一層膜）、裂片樣紅細胞等，則提示紅細胞來源于腎小球，稱為腎小球血尿，主要見于各種類型的急、慢性腎小球腎炎（包括繼發性腎損害，如紅斑狼瘡腎炎、糖尿病腎病）和腎小球腎病等；如果75%以上的紅細胞形態正常，為圓盤雙凹狀，則提示紅細胞來源于腎盂、輸尿管、膀胱和尿道，稱為非腎小球血尿，常見于腎盂腎炎、泌尿系結石、腎結核、腎或膀胱腫瘤以及外傷等。為了進一步明確診斷，可根據臨床需要建議病人到專科醫院做膀胱鏡、逆行性腎盂造影和動脈造影、腎超聲波檢查、腹部平片、CT檢查和腎穿刺活體檢查。三、白細胞尿尿沉渣檢查，如果鏡下白細胞數量超過5個／Hp，或者使用尿沉渣計數板定量檢查白細胞數男性≥5個／微升，女性≥12個／微升則診斷為白細胞尿。干化學法只能檢驗出尿液中性粒細胞，而不能檢驗出淋巴細胞和單核細胞，而不同的白細胞尿有顯然不同的臨床意義。因此當臨床需要時，應對尿液白細胞進行顯微鏡檢查。若尿中白細胞以中性粒細胞為主，伴有或不伴有尿液亞硝酸定性檢查陽性，則診斷泌尿系統感染。應進一步做中段尿細菌菌落計數和培養及體外藥物敏感試驗，醫生根據培養和藥敏試驗結果選擇抗生素，制定治療計劃。如果臨床上考慮淋病，應取尿道分泌物或陰道分泌物做淋球菌檢查。如果尿中白細胞以淋巴細胞或單核細胞為主，則應根據臨床考慮為免疫性腎損害，如系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征等，或者考慮腎移植患者出現排斥反應。四、上皮細胞尿的臨床意義腎小管上皮細胞增多提示腎小管病變，如急性腎小管壞死、間質性腎炎慢性腎小球腎炎、腎移植排異反應、慢性心力衰竭等。移行上皮細胞增多提示相應部位炎癥，見于腎盂腎炎、膀胱炎等。鱗狀上皮增多多見于尿道炎，女性患者應排除陰道分泌物污染。五、管型尿的分析和解釋1．管型的定義、形成條件和分類管型是指蛋白和／或細胞成分在腎小管和集合管所形成的圓柱狀物質。管型的形成需要三個基本條件：①蛋白尿；②腎小管具有對原尿的濃縮功能；③有可交替使用的腎單位。第一條說明腎臟有損害，后兩條則要求具有一定的腎功能。除了根據管型的構成將管型分為透明管型、顆粒管型、細胞管型、脂肪管型和蠟樣管型之外，還可根據管型橫徑大小分為：①狹窄型（為1～2個紅細胞直徑大小）；②中等寬度型（3～4個紅細胞直徑大小）；③寬型（5個紅細胞直徑大小）。寬型管型提示腎實質有嚴重損害。2．管型的臨床意義管型的臨床意義取決于管型的種類和數量。健康人尿液中可偶見透明管型。顆粒管型是腎實質損害的重要指征。大量蛋白尿和脫水時可出現透明管型。如果發現脂肪管型對診斷腎病綜合征有重要價值。白細胞管型常見于腎盂腎炎、狼瘡性腎炎和腎移植排斥反應。腎上皮細胞管型多見于腎小管損傷。蠟樣管型在慢性腎功能衰竭非常常見。寬大管型產生于腎單位中擴張的腎小管，常是腎臟疾病慢性遷延的表現，這種現象在狼瘡性腎炎比較常見。六、結晶尿的臨床意義生理性結晶尿來自食物及機體正常代謝，但大量草酸鈣結晶可診斷尿路結石。病理性結晶尿與疾病因素和某些藥物代謝有關，如膽紅素結晶見于各種黃疸患者和有機磷中毒；胱氨酸結晶，與腎和膀胱結石有關；亮氨酸與酪氨酸結晶，見于急性肝壞死、急性有機磷中毒、糖尿病昏迷、白血病等。膽固醇結晶，見于膀胱炎、腎盂腎炎或有乳糜尿的患者；磺胺結晶，與使用磺胺藥物有關，應立即停止用藥。七、小結蛋白尿診斷程序：蛋白尿→（排除生理性）病理性蛋白尿→尿液蛋白電泳：①小分子蛋白為主(b2-微球蛋白)→腎小管病變（結合臨床分析具體疾病）。②中分子蛋白為主(白蛋白、轉鐵蛋白)或是還有大分子蛋白(IgG)→腎小球病變→計算選擇性系數或電泳→判斷選擇性/非選擇性（見于原發性和繼發性腎小球疾病）。血尿診斷程序：肉眼血尿或鏡下血尿→（排除血紅蛋白尿）相差顯微鏡或其他手段觀察RBC形態。①75%以上正常紅細胞形態→非腎小球血尿，結合臨床考慮泌尿系結核、尿路感染、外傷、腫瘤等。②75%以上異常紅細胞形態→腎小球血尿→腎小球疾病(原發性和繼發性)。

核酸提取對臨床熒光PCR檢測質量的影響因素中國人民解放軍第302醫院王海濱

一、臨床分子生物學檢驗面臨的問題與挑戰（一）國家藥監局審評中心新行規：核酸提取是關鍵！1.HBVDNA敏感性報告<30IU/ML，防止實驗室污染問題！2.標本加樣量不少于200微升；干擾與敏感性的矛盾！3.核酸加樣量不少于20微升、反應體積不少于40微升！4.磁珠法應用的挑戰！血站核酸篩查？5.定量內標漂移對結果的影響6.試劑盒考核：增加抗污染和敏感性能評價指標！（二）不同核酸提取方法對檢測質量的影響影響核酸提取的因素有很多，以磁珠法、層析柱法、堿性裂解法及生物合成材料進行比較。標本：200微升血清方法：磁珠法：市場銷售試劑盒，介質為胍鹽、乙醇；層析柱法：市場銷售試劑盒，介質為胍鹽、乙醇；堿性裂解法：PEG介導；生物合成材料：無胍、無醇。PCR擴增：取等體積提取核酸或磁珠懸液（10微升），同一PCR擴增液。我們采用四種方法材料進行同一樣本核酸提取，然后采用統一試劑對相同提取核酸進行PCR擴增，結果差別非常大，磁珠法和層析柱法基本差不多，層析柱法稍微滯后于磁珠法，堿性裂解法最差，而且100IU無結果。復合材料的敏感性，是磁珠法或層析柱法的30倍左右。過去，我們對熒光PCR試劑或分子生物學試劑，往往關注擴增部分，而把提取部分忽視了，現在來看，提取部分也非常重要。二、臨床實驗室核酸制備方法分類（一）臨床實驗室核酸制備基本方法基本的方法有四種：1.煮沸法最常用的是PEG聚乙二醇6000，血清和提取液混勻，之后使病毒沉淀，離心，然后對沉淀物進行高熱電解試驗。有文章提出，棄掉的上清含有的病毒更多。2.一管法血清加到微量的裂解液里面混勻，試液配好以后，加進去就可以了。目前市場上有幾家公司都用該檢測方法。從臨床檢驗的角度來說，一管法略微簡略。但是敏感性，已經達到了100IU，而且其穩定性非常好。不用煮沸，或者經過簡單的煮沸。雖然目前藥監局審評中心，不提倡用一管法，但是一管法的穩定性，抗污染性，簡易程度，實際上優于磁珠的方法。因為磁珠非常小，而且在乙醇下，非常容易揮發，易導致實驗室的污染，3.層析柱法層析柱法優于磁珠法，沒有發生漂浮的情況，雖然也可以導致污染，但污染源限于液體，即使用試劑中的污染物。比如普通的篩查，建議大家用一管法來做，畢竟經濟、簡便、快速等，敏感性達到100IU，也能滿足臨床的需要。（二）磁珠或層析柱胍鹽提取核酸多步驟的弊端乙醇在核酸提取中的利與弊的關系，由于乙醇容易蒸發，在磁珠里面的乙醇容易揮發造成污染。大家不妨做一個試驗，在乙醇里面加上磁珠，放在玻片上，在顯微鏡下看一看，可以看到在乙醇里面的磁珠就像巨峰一樣，波濤洶涌。在玻片邊緣的磁珠，隨著乙醇蒸發而迸濺。所以，很容易發生交叉污染，而且非常嚴重。磁珠和層析柱方法關聯的次序，有病毒裂解，然后核酸吸附，還有漂洗，最后是洗脫。目前診斷試劑HBVDNA，HCVRNA，HIVRNA等，第一個過程是病毒裂解以后，把磁珠收集了，然后漂洗、洗脫。（三）層析柱法核酸丟失1.過濾核酸丟失PPT6顯示的是過濾液再過柱5次取得核酸，第一次過濾的液體，為1慮，再過濾一次，為2慮，然后反復一直到5慮。圖中是高含量、中含量與低含量，低含量是100IU左右，也就是說，濾下來的東西再過濾，還有核酸被收集到的，這就是核酸的丟失。PPT7顯示的濾過液再進行核酸提取5次數據，通過計算發現，丟失率為60%以上。PPT8顯示的是5次過濾丟失的曲線圖，過濾液中存在核酸的丟失，不同濃度標本的核酸的丟失差異較大。2.洗脫核酸丟失PPT9顯示的是層析柱反復洗脫核酸的丟失，進行了七次洗滌。結果發現第一次洗脫核酸量較高，2洗到7洗，核酸含量基本上差不多，這也是丟失的環節。PPT10顯示的是層析柱反復洗脫核酸數據。PPT11顯示的是7次洗脫核酸丟失率的圖，不同濃度標本中層析柱上的殘留核酸，差異也較大。PPT12顯示的是高濃度標本反復洗脫得到的PCR曲線和Ct值，進行了17次洗脫，可以看到，從第九次或者第八次以后，基本上在18、19左右徘徊，即最后會達到一個平臺，說明層析柱粘附的核酸量非常多。PPT13顯示的是洗脫液加熱對照得到的Ct值，可以看到，加熱洗脫，核酸洗脫下來的量明顯升高。（四）PEG提取法核酸丟失情況PPT14顯示的是PEG提取法核酸的丟失，PEG和血清或血漿混勻以后，沉淀的上層還含有大量的病毒。PEG存在很多的問題，沉淀很難再混勻，故每次檢測結果可能明顯的不同，這也是PEG的方法最后被取消的原因之一。（五）血清標本干擾物質對熒光PCR檢測的影響PPT15顯示了干擾物質的羅列，分為溶血組、脂血組、黃疸組，及對照組。可以看到，這三種方法是可比的。干擾最大的是黃疸組，但是這幾個方法的比較呢，實際上沒有質的差異。PPT16顯示的是兩個一管法的比較，可以看到，一管法1有一個特點：干擾物質的影響不大。但是一管法2干擾物引起波動。由于一管法1中的蛋白做了消融，一管法2在室溫混勻以后，直接加反應液，故有差異。因此在臨床上，更為主張采用一管法1，也就是做溫處理，使里面的干擾物質清除。（六）不同核酸吸附材料（磁珠）PPT17顯示的是不同核酸吸附材料的影響，實驗中用了兩種不同的裂解液與兩種不同的磁珠：1.磁珠1不同裂解液比較發現，高中低拷貝的標本都一樣。2.磁珠2不同裂解液比較發現，高中低拷貝的標本明顯不同。說明磁珠的材料對檢測結果的影響很大。（七）同一試劑，不同核酸提取方法不同的提取方法，核酸的丟失也不一樣。提取樣本量與核酸得率的關系，是1＋1≠2現象，即加入的血清量，并不是越多越好，比如加100微升或50微升的血清，并不是加100微升血清核酸提取得率，一定是加50微升血清的一倍。實際上有時血清加的越多可能干擾物質越多，這要通過不同的實驗進行驗證。對100μl高中低含量HBVDNA血清采用COBASTaqMan、羅氏Meg2.0核酸提取儀和本實驗室建立的磁珠法進行核酸提取，同時采用同一試劑進行定量。試驗發現有的核酸提取方法，核酸丟失率非常大。三、核酸提取的交叉污染（一）儀器核酸提取的交叉污染PPT19顯示的是核酸提取儀，這種儀器有很多種，國產的、臺灣的、進口的。它們幾乎都有一個共同的特點：交叉污染。雖然好多廠家都做了相應的調整，但到目前為止，沒有完全不污染的。PPT20顯示的儀器是MegNAPure2.0(Roche)。PPT21是全自動的核酸提取和擴增系統。PPT22顯示的是核酸提取儀核酸污染情況，這是最早的數據，交叉污染的實驗設計：某核酸提取儀109與陰性對照間隔進行核酸提取并檢測。連續做了八個陽性和八個陰性對照，發現有四個對照發生了交叉污染，污染率很高。（二）實驗室污染的監控實驗室污染的監控，是熒光實驗室或分子生物學實驗室的重中之重，分為試劑污染、環境污染、核酸提取污染，而且污染曲線有一定的特征。（三）幾種防污染措施的效果評價污染是目前臨床分子生物學實驗室比較頭疼的問題，也是實驗室真正的水平的體現。防污染的措施有很多，最有效的是實驗室的通風。抗污染有效性實驗：1.紫外線照射對擴增產物有一定的效果。2.有效氯處理效果一定！但要注意對熒光探針的淬滅！3.酒精擦拭無效且容易導致污染物遷移。4.高壓處理容易導致交叉污染，并可引起器具變形（吸頭、離心管）。（四）污染的預防1.預防污染的常規工作1）嚴格的實驗室分區與管理：物品單獨使用的好處2）經常性實驗室通風：能對流通風的重要性，封閉實驗室的弊端。3）每周有效氯消毒液擦拭:(84消毒液，健之素等),桌面、地面清洗4）每日清水擦拭實驗用品：流水清潔的重要性，對實驗用品如試管架、吸頭盒、離心機內面等。5）移液器的處理：即時進行流水清洗，除非細菌培養實驗無需高壓和消毒。2.人員培訓與管理污染環節的認知(按來源分類),有效預防污染操作的實現，實驗室新進人員的培訓、考核與上崗。3.實驗室生物廢物的管理：標本接觸廢物、試劑廢物、擴增產物等。尿液生化檢查首都醫科大學附屬北京安貞醫院左大鵬

一、尿干化學法評價生化檢查包括蛋白、糖、酮體、膽紅素和尿膽原、隱血試驗、白細胞、亞硝酸鹽試驗、尿比密檢驗、尿酸堿度（pH）檢驗和維生素C。尿十項（—），排除泌尿系統疾病；尿蛋白、隱血、WBC、亞硝酸鹽中任一項（+），需顯微鏡檢查等確認。尿干化學法是泌尿系統疾病的過篩試驗。二、尿蛋白檢驗（一）干化學法1．檢驗原理測定基于“指示劑蛋白誤差”原理，即蛋白可以改變某些酸性指示劑的顏色而不會改變pH值。溴酚藍（指示劑）經緩沖后pH值為3，在沒有蛋白存在的溶液中為黃色。蛋白質能與溴酚藍起顏色反應，如果尿液中有蛋白，則顏色根據濃度情況變為綠色或藍色，蛋白質含量的多少與顏色深淺成正比。2．方法學評價該方法對白蛋白比球蛋白敏感，測量球蛋白的敏感性僅是白蛋白1/100～1/50，尿液中球蛋白常不易被檢測，因此如果是以球蛋白為主的蛋白尿，如非選擇性蛋白尿和本周蛋白尿可出現假陰性結果。這時最好使用磺柳酸法和雙縮脲法進行定性試驗或定量測定。試紙法測定尿蛋白操作簡單快速、敏感性高，但在使用中應注意：①尿液必須新鮮，變質的尿液產生pH變化影響試驗結果，可能產生假陽性；②病人服用奎寧和嘧啶等藥物引起的強堿性尿時，會出現假陽性結果。鑒別方法是用稀醋酸將尿液pH值調至5～7，再行實驗，借以區別是否由于強堿性尿而導致的假陽性；③許多藥物可影響尿蛋白檢查的結果，例如大劑量青霉素可使之產生假陰性結果；④標本內含有其他分泌物或含有較多細胞成分時，可引起假陽性。所以，NCCLS建議磺柳酸法作為模塊檢測尿蛋白的參比方法。（二）傳統尿蛋白檢驗1．定性試驗常用的有加熱醋酸法和磺基水楊酸法等。（1）加熱醋酸法：原理是加熱煮沸使蛋白變性、凝固，然后加酸使尿pH接近蛋白質等電點（pH4.7），有利于已變性蛋白下沉，同時可消除尿液中某些磷酸鹽因加熱析出所致的混濁。此方法干擾因素少，但如加酸過少或過多，都會導致遠離等電點，使陽性減弱。如尿中鹽濃度過低，也可出現假陰性。本法檢測尿蛋白的敏感度為0.15g／L。（2）磺基水楊酸法：原理是在略低于蛋白質等電點的pH條件下，帶有正電荷的氨基與帶有負電荷的磺基水楊酸根相結合，形成不溶性蛋白質鹽而沉淀。此方法操作簡單，白蛋白、球蛋白和本周蛋白均可發生反應。但當患者使用青霉素鉀鹽、SMZ、PAS和有機碘造影劑后，或在高濃度尿酸、草酸鹽及黏蛋白等情況下均可發生假陽性，但加熱煮沸后消失，有別于蛋白尿。本法檢測尿蛋白的敏感度為0.05～0.1g／L。2．定量測定有多種方法，如沉淀法、比濁法（磺基水楊酸-硫酸鈉法）、比色法（雙縮脲法）、染料結合法（考馬斯亮藍法、麗春紅法、溴酚藍法和鄰苯三酚紅鉬法）和免疫測定法等，可根據實驗室條件進行選擇。三、尿糖檢驗1．干化學法檢驗原理干化學法檢測尿糖只針對尿液中的葡萄糖，而不像傳統的斑氏法（硫酸銅法）還可與其他糖分進行反應（如果糖、乳酸、戊糖等）。干化學測定尿糖的原理是基于葡萄糖氧化酶法，即葡萄糖氧化酶把葡萄糖氧化成葡萄糖醛酸和過氧化氫，后者再由過氧化氫酶催化釋放出新生態氧（O），使色源呈現不同的顏色變化。反應式如下：葡萄糖+氧（空氣中）——葡萄糖酸+過氧化氫過氧化氫+顯色集團——顯色氧化物+水2．方法學評價此法優點在于特異性強，只與葡萄糖反應。靈敏度高，葡萄糖含量為0.3～0.5g／L即可出現弱陽性。但是尿液內含有對氧親和力較強的還原性物質（如維生素C）可與干化學法試紙上的試劑發生競爭性抑制反應呈假陰性。此外當尿糖濃度較低時（例如低于14mmol／L）可造成假陰性結果。四、尿酮體檢驗1．干化學法檢驗原理酮體測定屬于硝普鹽反應，檢測尿酮體的模塊中含有亞硝基鐵氰化鈉可與尿液中的乙酰乙酸、丙酮產生從淺黃色到紫紅色的反應。2．方法學評價本方法對乙酰乙酸的敏感性為5～10mg／dl，對丙酮僅為40～70mg/dl，不與b-羥丁酸起反應。結果分析時應特別注意不同病因引起的酮癥，酮體的成分可不同，即使同一病人在不同病程時也會有差異。在糖尿病酸中毒早期病例中，主要酮體形式是b-羥丁酸，乙酰乙酸很少或缺乏，此時測量可導致假陰性；而在糖尿病酮酸中毒癥狀緩解之后，乙酰乙酸含量反而比初始急性期含量高，檢測結果又會影響醫生對病情的正確估計。因此檢驗人員必須注意病程發展，與臨床醫生共同分析實驗結果的可靠性。由于尿酮體中的丙酮和乙酰乙酸都具有揮發性，乙酰乙酸更易受熱分解成丙酮，尿液被細菌污染后，酮體消失，因此，尿液必須新鮮，及時送檢。某些含有巰基的藥物，如巰甲丙脯酸可引起假陽性反應，某些儀器由于受分辨率的制約也可能產生假陽性結果。五、膽紅素和尿膽原檢驗1．干化學法檢驗原理尿膽紅素測定原理是結合膽紅素在強酸性介質中，與2，4-二氯苯胺重氮鹽起偶聯反應呈紫紅色。尿膽原測定原理是在強酸條件下尿膽原和對-甲氧基苯重氮四氟化硼發生重氮鹽偶聯反應，生成胭脂紅色化合物。2．方法學評價檢測中注意：①標本必須新鮮并避光，以免膽紅素在陽光照射下成為膽綠素；尿膽原氧化成尿膽素，造成檢測結果偏低或出現假陰性反應；②尿液中含高濃度維生素C和亞硝酸鹽時，抑制偶氮反應使尿膽紅素呈假陰性；當患者接受大劑量氯丙嗪治療或尿中含有鹽酸苯偶氮吡啶的代謝產物時，可呈假陽性；③尿液中一些內源物質如膽色素原、吲哚、膽紅素等可使尿膽原檢查結果出現假陽性，一些藥物也可產色干擾試驗結果。六、尿隱血檢驗1．干化學法檢驗原理尿液中紅細胞內的血紅蛋白或其破壞釋放的血紅蛋白均含有亞鐵血紅素，后者具有過氧化氫酶樣活性，可使氧化物分解釋放出新生態氧（O），（O）能使無色的鄰甲聯苯胺（或者四甲替聯苯胺）變成藍色的物質呈現出從綠色到暗藍色反應。2．方法學評價因為不同型號的試紙帶的敏感度不同，使用時必須注意批間差。一般敏感度是游離血紅蛋白0.015～0.06mg／dl，紅細胞5～20個／微升。該法既可對完整的紅細胞反應又能測定游離的血紅蛋白量，無法鑒別血尿和血紅蛋白尿，因此報告時要了解臨床診斷，綜合分析，排除兩者對檢測結果的相互影響。腎病患者終尿中的紅細胞由于各種因素變形、裂解使血紅蛋白溢出，可導致儀器法與目測法的差異。在紅細胞濃度大于20～30個／微升，標本放置時間過長，尿液滲透壓低（＜300mOsm／kgH2O＝或比重＜1.010時，由于紅細胞的破壞，其測定結果偏高。血紅蛋白尿和肌紅蛋白尿可造成對血尿的假陽性結果。尿液被次氯酸鹽和細菌過氧化物酶的污染，也可出現假陽性結果。尿液中高濃度的維生素C可出現假陰性結果。七、白細胞檢驗1．干化學法檢驗原理基于粒細胞漿內含有脂酶可作用于模塊中的吲哚酚脂，并與重氮鹽反應形成紫色縮合物，其顏色深淺與細胞的多少成比例關系。2．方法學評價操作時應注意：尿液標本必須新鮮，留尿后盡量立即測定，以免白細胞破壞，導致試紙法與鏡檢法人為的實驗誤差。此法只能檢測粒細胞，并不與單核細胞、淋巴細胞反應，在腎移植病人發生排異反應時尿中以淋巴細胞為主或其他病因引起的單核細胞尿時會產生陰性結果。尿液中污染甲醛或高濃度膽紅質或使用某些藥物時，可產生假陽性；尿蛋白大于5克／升或尿液中含有大劑量頭孢氨芐或慶大霉素等藥物時，可使結果偏低或出現假陰性結果。造成干化學法檢驗尿液血細胞誤差的原因見表2-1。表2-1干化學法造成尿液中紅細胞和白細胞檢測假陽性和假陰性的原因試驗結果常見原因紅細胞

假陽性尿液中含有對熱不穩定酶、肌紅蛋白、菌尿、低比密尿、尿pH增高假陰性大量維生素C（＞100mg／L）、大量蛋白尿、高比密尿、pH＜5．0、樣品未混勻、試紙條Hb靈敏度未達到150mg/L白細胞

假陽性高濃度膽紅素尿、服用呋喃坦啶等藥物假陰性高比密尿、大量蛋白尿（＞5g／L）、大量尿糖（10～20g／L以上）、使用大劑量頭孢氨芐、慶大霉素后以及尿中有高濃度草酸

八、尿亞硝酸鹽檢驗1．干化學法檢驗原理大多數尿路感染是由大腸桿菌引起的，正常人尿液中含有來自食物或蛋白質正常代謝產生的硝酸鹽。當尿液中大腸桿菌增殖時，可將尿液中硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽可將模塊中對氨基苯砷酸重氮化而成重氮鹽，重氮鹽與1，2，3，4-四氰并喹啉-3

酚偶聯使模塊產生粉紅色，借以診斷患者是否被大腸埃希菌感染。其檢出敏感度為0.03～0.06mg／dl。2．方法學評價尿液中亞硝酸鹽檢出率受感染細菌是否含有硝酸鹽還原酶，食物中是否含有適量的硝酸鹽和尿液標本是否在膀胱停留間隔4小時以上三方面的影響，符合上述三個條件，此實驗的檢出率為80％，反之呈陰性結果。因此本實驗陰性并不能排除菌尿的可能，如果引起泌尿系統感染的致病菌（例如糞鏈球菌）不含有硝酸鹽還原酶，此試驗為陰性結果。同樣亞硝酸鹽試驗陽性也不能完全一定泌尿系統感染，因為標本放置過久或污染也可呈假陽性，應結合其他尿液分析結果，綜合分析得出正確的判斷。大量維生素C也可造成假陰性結果。九、尿比密檢驗1．干化學法檢驗原理是采用經過處理的多聚電解質的pKa改變與尿液離子濃度相關，試紙條中的多聚電解質含有隨尿標本中離子濃度變化而解離的酸性基團；離子濃度越大，酸性基團解離越多，使模塊中的pH改變。這種改變可由模塊中的pH指示劑的顏色變化顯示出來，進而換算成尿液的比重值。2．方法學評價在應用中應注意：①尿液標本必須新鮮，不能含有強堿、強酸性物質，當尿液pH≥7時，應在測定結果的基礎上增加0.005作為由于尿液pH損失的補償；②尿液中非離子化合物增多時，可導致尿比重懸浮法和折射儀法測定結果偏高，而試紙法只與離子濃度有關，不受影響；③尿液中蛋白增多時，三種方法都有不同程度的增加，以試紙法最為明顯，折射儀法次之；④試紙法不宜用于新生兒尿比重檢查，這可能是由于新生兒尿比重在1.002～1.004之間的緣故。NCCLS建議折射儀結果作為尿試紙的參比方法，比重計法不再使用。十、尿酸堿度（pH）檢驗1．干化學法檢驗原理采用指示劑法，檢測模塊區含有甲基紅（pH域值為4.6～6.2）和溴麝香甲酚藍（pH域值為6.7～7.5），兩種酸堿指示劑適量配合可反映尿pH4.5～9.0的變異范圍。2．方法學評價檢測時尿標本必須新鮮，放置過久細菌分解尿液成分可導致pH改變。試紙條應按規定的時間浸泡，浸尿時間過長，尿pH呈減低趨勢。尿pH檢測不僅可以了解體內酸堿平衡情況，還可監控尿pH變化對其他模塊區反應的干擾作用，如尿蛋白測定、尿比重測定均受尿pH影響。十一、維生素C檢驗采用還原法，靈敏度約為50～100mg／L。設立尿液維生素C檢驗的目的是為了幫助檢驗人員和臨床醫生在分析干化學檢測結果時排除維生素C對某些項目的影響。因為尿液中維生素C增加，可抑制尿液隱血試驗、膽紅素試驗、葡萄糖試驗和亞硝酸鹽試驗的反應而使上述檢驗出現假陰性結果。十二、小結尿干化學法是泌尿系統疾病的過篩試驗。尿液顯微鏡檢查首都醫科大學附屬北京安貞醫院左大鵬

一、概述尿液顯微鏡檢查是對尿沉渣進行的顯微鏡檢查，主要檢查尿液中的有形成分，這對于診斷泌尿系統疾病具有極其重要的意義。（一）尿沉渣檢查的指征1．美國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）規定凡有下述情況的應進行顯微鏡檢查（1）醫生提出鏡檢要求的。（2）檢驗科規定的患者（如泌尿科、腎病科、糖尿病、應用免疫抑制劑患者及妊娠婦女）。（3）任何一項物理學、化學檢驗結果異常的。2．我國檢驗學會規定凡隱血試驗、白細胞、蛋白和亞硝酸鹽試驗四項干化學檢查中有任何一項不正常者都應進行顯微鏡檢查，并以顯微鏡檢查報告為準。（二）尿沉渣檢驗程序尿液標本推薦晨尿，留取后立即送檢，放置時間不應超過1個小時。1．顯微鏡檢查尿沉渣制備完成之后，把尿沉渣滴在玻璃片上了，蓋上一個蓋玻片，在顯微鏡下進行觀察，首先我們在低倍鏡下看尿沉渣的分布情況，再轉到高倍鏡去觀察細胞。計數細胞的時候，至少數10個高倍鏡視野；因為管型比較少，計數管型時在低倍鏡下要觀察20個視野。分別計數每個視野的細胞管型數，計算平均值或按最少到最多報告，比如10個高倍鏡視野中，最少的是2個，最多的是5個，就報2-5，如果數量太多，也可以報告它所占視野的面積，有太多我們就報滿視野。報告方式，細胞在高倍鏡視野平均幾個，最少到最多幾個，管型也是低倍鏡視野，平均幾個，最少到最多幾個。尿結晶或鹽類數量，可以按照一個+，兩個+，三個+，四個+，同時你還要報告是哪一類的結晶。2．定量檢查，現在在很多醫院都是用一種叫尿沉渣定量分析版來做，我們就看一下，這就是一個專門給尿沉渣做定量的技術版，這一個塑料板上有10個計數的地方，可以做10個病人，我們把尿沉渣滴到技術盤里，這個技術盤大方格的面積整好是一個微升，所以我們報告的結果是一微升里有多少細胞，有多少紅細胞、有多少白細胞，有多少上皮細胞，有多少管型，所以叫定量。（三）尿沉渣檢查方法學評價不同的尿沉渣檢查法精密度相差懸殊，見表2-2，推薦使用尿沉渣定量分析板法。表2-2四種常見尿沉渣檢查法CV％值比較方法白細胞紅細胞普通載玻片不加玻片法15.017.0載玻片加蓋玻片法12.015.0改良Neubau