說明】蛋糕具有松軟香甜，攜帶方便、食用簡單等特點，因此成為人們居家生活特別是旅途中不可或缺的一種美食，深受人們的喜愛。測定蛋糕中的菌落總數可以用來判定其被微生物污染的程度及衛生質量，它反映蛋糕在生產過程中是否符合衛生要求，以便對被檢樣品做出適當的衛生學評價，菌落總數的多少在一定程度上標志著蛋糕產品質量的優劣，因此，測定蛋糕中的菌落總數具有重要意義。目前應用于測定食品中菌落總數的方法有:紙片法、電阻抗法等。本實驗采用國標法(GB\T對獨立包裝小蛋糕中菌落總數進行測定。并與GB7099-2003糕點、面包衛生標準中規定的冷加工糕點中菌落總數＜10000(cfu/g)的數據對比初步判斷樣品是否符合衛生要求。一、 實驗目的1、 學習并掌握測定蛋糕中菌落總數的方法及原理。2、 通過對比實驗驗證冷藏對蛋糕的保鮮及抑菌作用。3、 了解菌落總數測定在食品衛生學評價中的意義。二、 實驗原理菌落總數即為食品檢樣經過處理，在一定條件下(如培養基、培養溫度和培養時間等)培養后，所得每g(mL)檢樣中形成的微生物菌落總數。菌落總數主要作為判定食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖動態，以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供依據。每種細菌都有它一定的生理特性，培養時應用不同的營養條件及其他生理條件(如溫度、培養時間、pH、需氧性質等)去滿足其要求才能將各種細菌都培養出來。但在實際工作中，一般都只用一種常用的方法。細菌菌落總數的測定，所得結果，只包括一群能在營養瓊脂上發育的嗜中溫性需氧菌的菌落總數。菌落總數并不表示樣品中實際存在的所有細菌總數，菌落總數并不能區分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數，需氧菌數等。三、實驗設備與材料除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：恒溫培養箱：36°C±1°C,30°C±1°C。冰箱：2C?5°C。恒溫水浴箱：46°C±1°C。天平：感量為g。均質器。振蕩器。無菌吸管：1mL（具mL刻度）、10mL（具mL刻度）或微量移液器及吸頭。無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。無菌培養皿：直徑90mm。pH計或pH比色管或精密pH試紙。放大鏡或/和菌落計數器。范記原味蛋糕，烘烤類糕點（冷加工），執行標準（GB/T20977）四、試劑和培養基及其制備平板計數瓊脂培養基成分:胰蛋白胨g；酵母浸膏g；葡萄糖g；瓊脂g；蒸餾水1000mLpH±制法:將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調節pH。分裝試管或錐形瓶，121C高壓滅菌15min。磷酸鹽緩沖液成分:磷酸二氫鉀（KH2PO4） g；蒸餾水500mL;pH制法貯存液：稱取g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液mL，用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于適宜容器中，121C高壓滅菌15min。無菌生理鹽水成分:氯化鈉g；蒸餾水1000mL制法稱取g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121°C高壓滅菌15min。五、實驗步驟采樣在南寧市范記餅屋采購生產日期為當天的同批次的范記原味蛋糕，樣品為即食類預包裝食品,采樣時，取相同批次的最小零售原包裝，檢驗前要保持包裝的完整，避免污染［3］。采集樣品的標記應對采集的樣品進行及時、準確的記錄和標記，采樣人應清晰填寫采樣單（包括采樣人、采樣地點、時間、樣品名稱、來源、批號、數量、保存條件等信息）［3］。采集樣品的貯存和運輸采樣后，應將樣品在接近原有貯存溫度條件下盡快送往實驗室檢驗。運輸時應保持樣品完整。如不能及時運送，應在接近原有貯存溫度條件下貯存［3］。樣品處理實驗室接到送檢樣品后應認真核對登記,確保樣品的相關信息完整并符合檢驗要求。實驗室應按要求盡快檢驗。若不能及時檢驗，應采取必要的措施保持樣品的原有狀態，防止樣品中目標微生物因客觀條件的干擾而發生變化［3］。檢驗員分組實驗時檢驗員分A、B、C三大組，每大組再分別分為三個小組，各組分工如下：A組測打開包裝后4C保存5h的樣品，A1、A2、A3三個小組分別測三個不同稀釋度樣品B組測打開包裝后常溫下存放5h的樣品，B1、B2、B3三個小組分別測三個不同稀釋度樣品C組做空白對照實驗。樣品的制備與稀釋試樣的前處理進入無菌室后，先打開酒精燈，用酒精棉球擦試手及樣品外包裝，如為原包裝，用滅菌鑷子夾下包裝紙，采取糕點不同部位的樣品25g置入盛有225mL的滅菌生理鹽水的無菌均質杯內，8000~10000r/min均質1~2min，制成1：10的樣品勻液。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。按操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。根據對樣品污染狀況的估計，選擇2個?3個適宜稀釋度的樣品勻液，在進行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。及時將15mL?20mL冷卻至46°C的平板計數瓊脂培養基（可放置于46°C±1°C恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。培養由于糕點樣品中可能含有在瓊脂培養基表面彌漫生長的菌落［2，］因此待瓊脂凝固后，在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養基（約4mL）,凝固后翻轉平板,36C±1C培養48h±2h。菌落計數可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（colony-formingunits,CFU）表示。選取菌落數在30CFU?300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數。當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。六、結果與報告菌落總數的計算方法若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g（mL）樣品中菌落總數結果。若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按公式（1）計算N=2C/（n+O.ln）d 、12 （1）式中：N——樣品中菌落數；工C――平板（含適宜范圍菌落數的平板）菌落數之和；n1――第一稀釋度（低稀釋倍數）平板個數；n2――第二稀釋度（高稀釋倍數）平板個數；d――稀釋因子（第一稀釋度）。若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。若所有稀釋度的平板菌落數均小于30CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU?300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。表1稀釋度選擇及菌落數報告方式例次稀釋液及菌落數兩稀釋液之比菌落總數個/g或ml報告方式個/g或ml10-110-210-31多不可計16420—1640016000或X1042多不可計295463775038000或X1043多不可計271602710027000或X104

4多不可計多不可計313—31300310000或X105527115—270270或X1026000—<1X10<107多不可計30512—3050031000或X104菌落總數的報告菌落數小于100CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數報告。菌落數大于或等于100CFU時，第3位數字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數字，后面用0代替位數；也可用10的指數形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數字。若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。稱重取樣以CFU/g為單位報告。表2小組結果記錄皿號菌落數稀釋度abc報告數1號皿2號皿空白對照皿1空白對照皿2七、注意事項在長期的工作實踐中發現糕點類樣品在進行細菌總數培養的時候，容易產生菌落的蔓延，鑒于這種情況，在樣品處理的時候應注意充分均勻，稍作沉淀并吸上清液進行稀釋培養，在培養的時候，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養基（約4mL），凝固后翻轉平板，進行培養⑵。由于菌落總數產生誤差的最主要原因來原于檢驗人員的經驗水平，檢驗人員在選取平板進行計數就顯得尤為重要，所以在選取平板進行計數時要盡量選取30—300CFU之間無蔓延、無片狀菌落生長的平板進行計數，必要的時候要用放大鏡進行觀測。每次實驗須做空白對照，如果空白對照上有菌落生長，則此次所得結果無效⑵。由于檢驗時樣品數量通常比較多，為了提高工作效率保持操作的連續、方便檢測人員往往先將所有樣品稀釋后再傾注平板，這樣個樣品由稀釋至傾注平板的時間通常要lh以上。王淑香等⑷通過實驗發現樣品從稀釋到傾注平板的間隔時間越長測出的菌落總數的結果越高。因此，樣品從稀釋到傾注平板的時間最好不要超過20min.在進行菌落計數時,有一些樣品的殘渣會在視覺上與菌落混淆?因此，在進行計數時應該仔細分辨。菌落的形狀相對規則，比較有光澤度，更飽滿，而樣品的殘渣比較不規則，沒有菌落的飽滿度和光澤度。另外，還可向培養基中添加一定濃度的TTC可以使菌落成紅色，便于觀測和計數，但TTC的濃度不宜過高，否則會抑制菌落的生長[5]操作要快而準，包括取樣、加樣、注入培養基等。樣品抽取時要無菌操作，并及時送檢。微生物檢驗時以不超過兩人為度，檢測完要迅速進行培養。八、檢驗后樣品的處理檢驗結果報告后，被檢樣品方能處理。檢出