實時熒光定量PCR技術

原理、應用及實踐(RealtimeQuantitativePCR)RealtimeQuantitativePCR1ppt課件主要內容

Real-timeqPCR的定量原理2Real-timeqPCR的檢測方法3Real-timeqPCR的基本概念1Real-timeqPCR的解析方法42ppt課件PCR：基本原理Denaturation:94–96°CAnnealing:50–65°CExtension:70–75°C基本要素：

TemplatePrimersDNApolymerasedNTP,N=A,G,CorT3ppt課件

PCR：基本原理理想的PCR反應：

N=N0*2n實際的PCR反應：

N=N0*(1+E)nN0：初始模板量N：第n次循環后的產物量n：擴增反應的循環次數

E：擴增效率S形曲線，具有平臺效應4ppt課件

與普通PCR的對比同一個樣本進行96次重復傳統PCR檢測RealtimePCR檢測RealtimePCR--起點檢測：--起點量是樣本中起始的DNA量--“加入了500個拷貝”--具有重現性，誤差小傳統PCR--終點檢測：--終點產物量經過PCR放大的DNA量--“生成了500，0000，0000個拷貝”--不恒定，誤差大傳統PCR檢測5ppt課件Real-timeqPCR激發光發射光--在PCR反應體系中加入熒光基團。--熒光基團在激發光的作用下，產生波長更長的發射光。--利用熒光信號的變化動態監測整個反應過程。

熒光基團6ppt課件

擴增曲線（primarycurve）擴增曲線：隨著PCR反應的進行，擴增產物不斷累積，熒光信號強度不斷增加。每經過一個循環，收集一次熒光信號，通過熒光強度的變化監測擴增產物量的變化，從而得到擴增曲線圖。縱坐標：Rn（熒光值）橫坐標：cyclenumber（循環數）線性圖對數圖7ppt課件

熒光閾值（threshold）基線(baseline)：一般以PCR反應前15個循環的熒光信號作為本底信號熒光閥值(threshold)：擴增曲線上人為設定的一個值--缺省設置：PCR反應前3-15個循環熒光本底信號標準偏差的10倍--手動設置：大于樣本的熒光背景值8ppt課件Ct

值(CycleThreshold)Ct值：PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時，熒光值所對應的PCR循環次數。起始模板量基線閾值Ct值9ppt課件

Ct

值(CycleThreshold)Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，平臺期DNA拷貝數波動很大，但Ct值相對固定；Ct值則極具重現性10ppt課件Ct值可以確定初始模板量？

Rn=RB+X0

(1+E)N*RS第n個循環的總信號=本底信號+起始DNA數目*PCR擴增效率*單位信號強度當循環次數n=Ct時RCt=RB+X0

(1+E)Ct*RS兩邊同時取對數得:lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSCt=-lgX0/lg(1+E)+lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)

Ct=-klgX0+blgX0與Ct值呈線性關系根據Ct值可以計算出樣本中起始模板所含有的拷貝數起始拷貝數越多，Ct值越小。11ppt課件Rnvs.Cyclenumber--擴增曲線LogDNAvs.Ct--標準曲線.未知10410310610510210標準曲線(standardcurve)標準曲線分析--對已知或未知樣本進行系列濃度梯度稀釋12ppt課件y=-ax+b測定熒光定量PCR反應的有效性--線性的標準曲線：相關系數R2--擴增效率：擴增效率(E)=10-1/斜率-1標準曲線分析13ppt課件

熒光定量PCR檢測方法染料標記：

SYBRGreenI探針標記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

14ppt課件SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI

是一種與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結合才能發出熒光。熒光信號與雙鏈DNA分子數成正比，隨著擴增產物增加而增加。熒光信號強度與反應體系中所有雙鏈DNA分子成正比。15ppt課件5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitation--變性時，DNA雙鏈分開，無熒光信號。--延伸結束時，采集熒光信號。SYBRGreenI工作原理16ppt課件SYBRGreenI優點：

使用方便，成本低--僅需設計兩個引物通用性好--對DNA模板沒有選擇性需要在反應結束時，對產物做融解曲線分析。缺點：SYBRGreen與所有雙鏈DNA結合--引物二聚體或錯誤擴增產物造成假陽性--只能檢測單一模板，無法進行多重檢測17ppt課件將溫度對熒光強度的變化求導。(-dI/dT)

融解曲線(dissociationcurve)確認PCR反應產物的特異性對數圖譜原始圖譜18ppt課件融解曲線分析--非特異性產物--引物二聚體19ppt課件

Taqman

工作原理探針與靶序列配對（一段序列，兩個基團，5’

報告基團、3’淬滅基團）完整的探針，報告基團R發射的熒光被淬滅基團Q淬滅，沒有熒光產生。聚合酶的5’外切酶活性報告基團R與淬滅基團Q分離，發射熒光。RQReporterQuencherRQ熒光信號強度與結合探針的DNA分子成正比。20ppt課件Taqman工作原理

在退火過程中，探針與靶序列結合探針被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片斷游離報告基團發出熒光在延伸過程中，探針部分與靶序列分離21ppt課件

SYBRGreenI與Taqman對比Taqman特異性高--與特異靶序列結合對模板有選擇性--可進行多重PCR反應

SYBRGreenI

使用方便，成本低--僅需設計兩個引物通用性好--對DNA模板沒有選擇性22ppt課件

熒光定量PCR解析方法絕對定量

樣本中核酸的量（拷貝數、微克）--檢測某給定血液樣本中的病毒顆粒數，有6000個拷貝相對定量

不同樣本中目的基因表達量的差異--腫瘤組織和正常組織相比

某個基因的表達量mRNA改變了多少倍，改變了60倍23ppt課件絕對定量的步驟

拷貝數計算對標準品進行梯度濃度稀釋熒光定量PCR反應建立標準品未知樣品Ct代入標準曲線確定拷貝數質粒提取OD值測定計算待測樣本濃度/樣本分子量/待測樣本拷貝數標準品進行5-6個梯度稀釋標準品稀釋倍數為1024ppt課件絕對定量Sample--樣本起始濃度與Ct呈線性關系，根據已知拷貝的標準品作出標準曲線。--根據未知樣品的Ct值，推算出未知樣本量。以標準品為標桿25ppt課件相對定量參照樣本Calibrator用于比較結果的基準。26ppt課件相對定量特點選擇內參基因內參基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因housekeepinggene在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數恒定，受環境因素影響較小--文獻檢索--實驗篩選內參基因--同樣體積或重量的樣本所來源的細胞數目不同。--RNA抽提、反轉效率不同，操作中存在誤差。對樣本初始濃度差異進行均一化校正。27ppt課件2-ΔΔCt法成立條件：假設擴增效率為100%滿足條件：1）內參基因和目標基因的擴增效率接近2）內參基因和目標基因的擴增效率均為90%-110%假設條件：內參基因和目標基因擴增效率差異大于5%1）優化實驗條件，使擴增效率接近2）使用其他方法

相對定量方法28ppt課件2-ΔΔCt法

相對定量舉例29ppt課件

相對定量分析

待測樣品目的基因濃度待測樣品內參基因濃度

F=對照樣品目的基因濃度

對照樣品內參基因濃度假設條件：內參基因和目標基因擴增效率不同優點：實驗優化簡單缺點：每一輪實驗都必需做標準曲線

雙標準曲線法80%30ppt課件

相對定量舉例

雙標準曲線法31ppt課件

實驗流程32ppt課件

SYBRGreen法實驗流程樣本處理RNA提取qPCR數據分析逆轉錄33ppt課件樣本處理與RNA提取外界刺激

–10min

–可檢測的表達改變樣品離開定義環境–2min–裂解、固定細胞TRIzon（酚、異硫氰酸胍）

裂解液（氰酸胍，異硫氰酸胍，SDS）液氮RNA保存液小心DNA污染！使用DNase陰性對照34ppt課件逆轉錄逆轉錄引物選擇下游應用：是否檢測其它基因？AbundantRNA的干擾：mRNAortotalRNA？檢測靈敏度是否足夠？35ppt課件

RT-PCR一步法還是兩步法？兩步法:反轉錄和PCR擴增分兩步進行。步驟多但靈活多樣。cDNA可長期保留檢測多個基因。便于反應優化。在工作的初期。一步法：反轉錄和PCR擴增在同一管內完成。

簡便、快捷但只做一個基因，一旦失敗難以查找原因。在工作的成熟階段。36ppt課件熒光定量PCR體系Template

PrimersDNA聚合酶BufferanddNTPsDye37ppt課件總原則與普通PCR相同：避免引物二聚體，避免二級結構擴增片段長度（80-300bp)推薦做跨intron設計引物設計原則38ppt課件Mastermix使用Mastermix有效降低系統誤差--熱啟動酶Hotstar化學修飾，低溫下酶活抑制性強，熱復活需10minFastHotstar抗體修飾，熱復活僅需幾十秒--Buffer反應增強劑減少模板二級結構影響控制Mg2+濃度穩定劑--DyeRealSYBRGreenmixRealSupermix39ppt課件Mastermix的優化

新型熒光染料(SuperGreen)激發、發射波長與SYBRGreen近似對PCR反應抑制更輕微可使用較高濃度(>1uM,SYBRgreen<0.3uM)更亮，靈敏度更高較短的鏈延長時間對小片段DNA和ssDNA結合更弱減少背景，有效信號更強與更強的信號協同，使溶解曲線峰更窄，適合于HRM分析化學性質更穩定致突變性與毒性更弱SYBRGreenSuperGreen40ppt課件MasterMixROXPassiveReference不參與、不干擾PCR反應恒定發射熒光信號用于校正因信號檢測器到各孔間光路不同而導致的系統誤差。有不同系統，需參照儀器要求選擇。41ppt課件

誤差控制使用Mastermix配置預混體系設置生物學重復（不同個體）

技術性重復（復孔）陽性和陰性對照實驗環境控制試劑準備區核酸制備區反應液制備區熒光定量PCR反應區熒光定量PCR體系42ppt課件數據分析融解曲線：單一特異性產物擴增曲線：--Ct值大小--各復孔之間重復性--不同濃度梯度稀釋的間隔性標準曲線：--R2＞0.980或∣

r∣

＞0.990--反應效率盡可能高：90%-110%--目的基因的擴增效率接近內參基因43ppt課件操作注意事項為避免加樣誤差，保證重復性，配制預混體系配制反應體系時，液體要緩慢加至管底，減少吹打低速離心，充分混勻，如有氣泡短暫離心不要直接在八連管上進行標記避光保存，試劑分裝避免反復凍融酒精擦拭移液器的吸頭設置反應重復（至少二個）設置對照44ppt課件案例分析總體原則偶然因素--操作原因實驗重復–

生物學重復、技術性重復機器因素–

儀器加樣孔結合擴增曲線、融解曲線、標準曲線分析單孔和多孔分析內參基因和目的基因對比分析45ppt課件案例分析–擴增曲線曲線拐點清楚，特別是低濃度樣本指數期明顯。擴增曲線整體平行性好，基線平而無上揚現象。模板進行梯度稀釋時，各濃度間隔性好。

Ct15-35重復性

46ppt課件擴增曲線--低濃度樣本沒有稀釋好--重復性差，加樣存在誤差案例分析–擴增曲線47ppt課件案例分析–擴增曲線無信號或Ct值偏大內參基因和目的基因均無信號--RNA降解內參基因和目的基因均偏大--模板量低--對未知濃度的樣品應從稀釋最高濃度做起內參基因正常，而目的基因偏大或無信號

--引物設計--目的基因表達量低48ppt課件案例分析Q．內參基因與目的基因的Ct值之差在多大范圍內可以接受？A：--在使用2-△△Ct法計算的前提是，公式成立的條件是內參基因和目的基因的擴增效率相接近并且足夠高，在90%-110%之間，因此內參基因與目的基因的差值是可以接受的。--內參基因和目的基因的Ct值在15-35以內，并且重復管之間的重復性很好，這樣的數據都是可以接受的。49ppt課件案例分析–擴增曲線擴增曲線不平滑--樣本濃度太低--原始信號弱關閉ROX校正信號50ppt課件案例分析–擴增曲線擴增曲線很早揚起--樣本濃度太高（稀釋樣品濃度）51ppt課件案例分析–熔解曲線熔解曲線出現雙峰引物峰：--陰性對照（體系污染，配合擴增曲線）--降低引物濃度--重新設計引物非特異性擴增--基因組污染--非特異片段（重新設計引物）52ppt課件案例分析–熔解曲線非正常熔解曲線--試劑污染--儀器需要校正53