手足口病標本采集

及檢測技術方案1目錄1病原學5二、標本采集注意事項6三、實驗室檢測操作流程7四、生物安全4一、采集標本的種類、保存和運輸2國外流行概況3我國流行概況2病原學

手足口病（hand,footandmonthdisease,HFMD）是由腸道病毒引起的急性傳染病，多發于10歲以下嬰幼兒，以手、足、口腔等部位皮膚黏膜的皮疹、皰疹、潰瘍為典型表現，個別患者可出現心肌炎、肺水腫、無菌性腦脊髓膜炎、腦炎等并發癥。手足口病并不是一種新發傳染病，自1957年首次報道以來，曾在許多國家和地區多次流行。2006年世界衛生組織公布該病在須申報疾病的發病率中居第四位。該病全年皆可發生，我國以夏秋季多發，是可防、可治且預后較好的小兒常見傳染病。中華人民共和國衛生部于2008年5月2日起，將該病列為丙類傳染病管理。背景知識3病原學

引起手足口病（HFMD）的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括：

柯薩奇病毒

A組（CoxasckievirusA,CVA）的2、4、5、7、9、10、16型等

B組（CoxasckievirusB,CVB)的1、2、3、4、5型等；

腸道病毒71型（HumanEnterovirus71,EV71）；

埃可病毒（Echovirus,ECHO）等。

背景知識4病原學其中以EV71和CVA16為主要病原。近年來我國陸續出現這兩種病原引起的HFMD季節性流行，局部呈強流行態勢。由此，HFMD的有關研究日益受到人們的重視。目前對于HFMD感染尚沒有特效的疫苗和藥物，主要采用對癥和支持治療，積極防止發生并發癥，因此加強疾病及病原的監測、準確處置疫情、開展健康教育是控制的關鍵。背景知識5國外流行概況

手足口病是一種全球性傳染病，世界大部分國家和地區均有此病流行的報道。

1957年首先發生于加拿大，并于同年在新西蘭被最早加以描述和報告。

1958年加拿大初步查出CVA16病毒為本病病原。澳大利亞、美國、瑞典是最早出現手足口病的國家之一。

1959年英國伯明翰、美國加利福尼亞地區發生流行，并從患者皰疹液中分離出CVA16，并根據本病病變分布特點，被正式命名為“手足口病”

。6國外流行概況

1972年EV71病毒引起的手足口病在美國被首次確認，此后EV71感染與CVA16感染交替出現，成為手足口病的主要病原體。日本是手足口病發病較多的國家，歷史上發生過多次CVA16，EV71引起的大規模流行。7我國流行概況

1981年我國首次在上海市暴發手足口病。此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、青海、廣東和河南等省市陸續出現該病報道。

1983年天津發生由CVA16引起的手足口病暴發流行，5~10月間發生病例7000余例，經過兩年散發流行后，1986年出現了以托兒所及幼兒園為主的疫情暴發。

1995年武漢病毒研究所從手足口患兒標本中分離到EV71。

1998年深圳市防疫站同樣分離到EV71。8我國流行概況

1998年我國臺灣地區發生EV71感染引起的手足口病和皰疹性咽峽炎流行，檢測哨點共報告129106例患者，重癥患者405例，死亡78例，多為五歲以下幼兒。

2000年山東省招遠市手足口病暴發，市人民醫院共接診患兒1698例，最小年齡5個月，最大14歲，3例合并心肌炎死亡。

2008年安徽阜陽市發生較大規模手足口病疫情，共報告病例6606例，其中23例死亡。9一、采集標本的種類、保存和運輸（二）咽拭子標本（三）血清標本（四）皰疹液（六）尸檢標本（一）糞便標本（七）腦脊液標本（五）肛拭子標本10（一）糞便標本

采集病人發病3日內的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量5-8g/份，采集后立即放入無菌采便管內，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽，

4℃暫存12小時內送達實驗室；-20℃以下低溫冷凍保藏；

長期保存的標本存于-70℃冰箱。一、采集標本的種類、保存和運輸11（二）咽拭子標本采集病人發病3日內的咽拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。

4℃暫存并在12小時內送達實驗室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70℃冰箱。一、采集標本的種類、保存和運輸12（三）血清標本

在手足口病流行年份中應采集EV71和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發病0-7d）和恢復期（發病14-30d）雙份配對血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動態變化，評價血清學抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。將血清置于-20℃以下冰箱中冷凍保存。一、采集標本的種類、保存和運輸13（四）皰疹液

在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時采集多個皰疹作為一份標本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。所采集標本4℃暫存立即（12h內）送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。一、采集標本的種類、保存和運輸14（五）肛拭子標本采集病人發病3日內的肛拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有3－5ml保存液（含5%牛血清細胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。一、采集標本的種類、保存和運輸15（六）尸檢標本采集腦、肺和腸淋巴結等重要組織標本，每一采集部位分別使用單獨的消毒器械。每種組織應多部位取材，每部位應取2-3份約5-10g的組織，淋巴結2個，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。一、采集標本的種類、保存和運輸16（七）腦脊液標本出現神經系統癥狀的病例，可采集腦脊液標本，進行病毒分離或核酸檢測。采集時間為出現神經系統癥狀后3天內，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內)送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。但EV71感染神經系統時，很難在腦脊液中檢測到EV71病原。一、采集標本的種類、保存和運輸17一、采集標本的種類、保存和運輸臨床標本在運輸和貯存過程中要避免反復凍融。標本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時內送達實驗室。依照《人間傳染的病原微生物名錄》，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標本按B類包裝，置于冷藏保存盒內運輸，盡量縮短運輸時間。可采用陸路或航空等多種運輸方式，但在運輸過程中應采取保護措施，避免強烈震動、重力擠壓等現象。在送到省、地、市級CDC實驗室時，包裝盒內應帶冰且包裝完整。在上送標本的同時，需附帶相關的《手足口病病例臨床標本采樣登記表》。18標本種類采集方法保存運輸糞便發病3日內的糞便，5-8g/份，立即放入無菌采便管內，貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4℃暫存12小時內送達實驗室；-20℃以下低溫冷凍保藏；長期保存的標本存于-70℃冰箱。避免反復凍融。全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時內送達實驗室。按B類包裝，盡量縮短運輸時間。可采用陸路或航空等多種運輸方式，在運輸過程中應采取保護措施。咽拭子發病3日內的咽拭子，專用采樣棉簽，拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，貼上帶有唯一識別號碼的標簽。血清采集急性期（發病0-7d）和恢復期（發病14-30d）雙份配對血清。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，貼上帶有唯一識別號碼的標簽。-20℃以下冰箱中冷凍保存。皰疹液用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4℃暫存12小時內送達實驗室；-20℃以下低溫冷凍保藏；長期保存的標本存于-70℃冰箱。19標本種類采集方法保存運輸肛拭子發病3日內的肛拭子，用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有3－5ml保存液的15ml外螺旋的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4℃暫存12小時內送達實驗室；-20℃以下低溫冷凍保藏；長期保存的標本存于-70℃冰箱。避免反復凍融。全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時內送達實驗室。按B類包裝，盡量縮短運輸時間。可采用陸路或航空等多種運輸方式，在運輸過程中應采取保護措施。尸檢標本腦、肺和腸淋巴結等重要組織標本，每一采集部位分別使用單獨的消毒器械。每種組織應多部位取材，每部位應取2-3份約5-10g的組織，淋巴結2個，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，旋緊管蓋，貼上帶有唯一識別號碼的標簽。腦脊液出現神經系統癥狀的病例，采集出現神經系統癥狀后3天內，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，旋緊管蓋，貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4℃暫存12小時內送達實驗室；-20℃以下低溫冷凍保藏；長期保存的標本存于-70℃冰箱。20二、標本采集注意事項用于分子生物學診斷的標本采集與病毒分離標本的采集方法一樣。對于血清學診斷，急性期血清應該在發病后盡早采集，恢復期血清在發病兩周后采集。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在標本保存液中，如含5%牛血清維持液。為了保證檢測結果的準確性和有效性，標本應在病例發病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標本應冷凍保存。

在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離到病毒即可診斷該病毒為病因。21標本保存液的配置保存液Eagle`s液(MEM)80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml胎牛血清5.0ml7.5%NaHCO3溶液3.5ml青、鏈霉素（各10000U/ml）10ml22三、實驗室檢測操作流程（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）(四)Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）（一）病毒分離23（一）病毒分離2．病毒分離細胞系3．標本的處理4．接種和觀察（病毒分離）5．病毒分離結果解釋1.試劑配置三、實驗室檢測操作流程24（一）病毒分離1.試劑配置（1）細胞的生長液、維持液的配制見下表：生長液（GM）維持液（MM）Eagle`s液(MEM)86.5ml92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、鏈霉素（各10000U/ml）1.0ml1.0ml三、實驗室檢測操作流程25（一）病毒分離（2）糞便標本和肛拭子的處理液完全PBS液中加入P.S溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100μg/ml。

完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。三、實驗室檢測操作流程26（一）病毒分離用600～800ml蒸餾水溶解以上鹽類，加蒸餾水補至1000ml，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。試劑品名加入量NACL8.00gKCL0.20gNa2HPO4(無水)0.91gKH2PO40.12gA液：三、實驗室檢測操作流程27（一）病毒分離B液：試劑品名加入量MgCl2.6H2O0.10g試劑品名加入量CaCl20.10g溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。C液：溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。三、實驗室檢測操作流程28（一）病毒分離2．病毒分離細胞系許多細胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CVA16）生長。對于檢測手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CVA16等腸道病毒感染的標本均需接種到以下兩種細胞系：RD細胞，來源于人橫紋肌肉瘤細胞。HEp-2細胞，來源于人喉癌上皮細胞。三、實驗室檢測操作流程29（一）病毒分離3．標本的處理（1）糞便標本和肛拭子的處理操作步驟：1）在離心管上標記標本號；2）每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；3）在生物安全柜中將每一份糞便標本取大約2g加入標記好的離心管中（確保離心管上的標號與原始標本的標號一致）；肛拭子為2ml；4）剩余的原始標本最好留在原容器中，凍存于－20℃；三、實驗室檢測操作流程30（一）病毒分離5）確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min；6）在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機在1500g條件下離心20min；7）在生物安全柜中將每1份標本的上清液分別吸入2個有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應再用氯仿處理1次）；8）1管糞便懸液凍存于－20℃作為備份，另1管存于4-8℃以備接種。三、實驗室檢測操作流程31（一）病毒分離（2）皰疹液標本的處理皰疹液標本通常直接用于RNA提取或病毒分離。（3）腦脊液標本的處理腦脊液標本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標本的處理咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000rpm離心20min，用上清接種到細胞上或直接提取RNA。如果發現有細菌污染，須用濾器過濾除菌。三、實驗室檢測操作流程32（一）病毒分離4．接種和觀察（病毒分離）（1）通常使用８ml的斜面試管培養細胞，傳細胞時，每管加細胞培養液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康、無污染的。一個健康的單層細胞會在傳代后48小時左右形成；（2）倒掉生長液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）；（3）每一份標本需要同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記每支細胞培養管（包括標本的編號、日期、傳代數）；（4）每一種細胞至少標記一管作為陰性對照；三、實驗室檢測操作流程33（一）病毒分離（5）每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養溫度要求36℃。（或者使用吸附的方法接種病毒：接種標本前，倒掉生長液（GM），每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養溫度為36℃；吸附1小時后，換上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標本需同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞）。（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細胞培養管，以觀察有特征性的腸道病毒致細胞病變效應（CPE）的出現（如細胞變圓，折光增強并脫離管壁等）；三、實驗室檢測操作流程34（一）病毒分離（7）記錄接種管和對照管細胞所發生的變化至少一周，記錄CPE（1+—4+）、提示細胞受毒性反應、老化或污染的影響而發生的變化（1+，<25%;2+,25%-50%;3+,50%-75%;4+,75%-100%）；（8）如果有特征性的腸道病毒CPE出現，要如實記錄，并觀察直到75%的細胞發生變化（3+CPE），然后儲藏在－20℃以備二次傳代；（9）第一代培養見可疑細胞病變時應繼續傳代，待細胞病變穩定出現后－20℃或－70℃凍存；三、實驗室檢測操作流程35（一）病毒分離（10）一代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現，將病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以選用二代病毒進行鑒定；（11）如果7d之后沒有CPE出現，那么盲傳1代繼續觀察7d。（注意：同一病例標本的細胞培養物不能混在一起再傳代，例如：不同細胞的培養物應單獨傳代）；（12）盲傳兩代后，仍然沒有出現CPE的，則判定為陰性；（13）注意：如果接種后24h內出現CPE，很可能是標本中的非特異性成分導致的毒性反應。取三、實驗室檢測操作流程36（一）病毒分離100μl陽性分離物傳二代，繼續觀察；或者在接種標本吸咐1h后用維持液清洗細胞層，可能會降低毒性反應；（14）幾個概念：A：毒性反應：如果在接種后1-2d內細胞快速凋亡，這可能是由于標本中含有毒性物質而導致的非特異性毒性反應。這些已接種標本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型細胞中（此時是第二代）。如果又出現了毒性反應，那么應該取原始標本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細胞中。這時應被認為是第一代。

三、實驗室檢測操作流程37（一）病毒分離B：微生物污染：由于細菌污染而造成培養液混濁或細胞死亡經常使病毒造成的CPE無法確定或根本無法出現。重新取原始標本，用氯仿或抗生素處理，按上述步驟重新接種到新鮮細胞上。C：盲傳：有時一周之后傳代細胞會老化，甚至細胞對照也出現了病變。這時已接種標本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型的新鮮單層細胞中，再觀察7-10d。如果盲傳兩代后仍然沒有產生CPE，那么認為這個標本是陰性的。三、實驗室檢測操作流程38（一）病毒分離5．病毒分離結果解釋RD細胞支持HFMD的主要病原體——CVA16和EV71等多種腸道病毒的復制，CVA16和EV71均能在RD細胞培養中引起特殊的腸道病毒致細胞病變效應（CPE），表現為細胞圓縮、分散、胞漿內顆粒增加，最后細胞自管壁脫落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD細胞中生長的速度不同，EV71的生長速度要快于CVA16，表現為EV71感染RD細胞后出現CPE的時間比CVA16早，EV71接種細胞后出現CPE很快，但CVA16一般要經過2次以上傳代才出現明顯的CPE。三、實驗室檢測操作流程39（一）病毒分離

若在使用RD細胞分離的同時再增加HEp-2細胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其他可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2細胞中均不繁殖。三、實驗室檢測操作流程40（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度1．液體配制2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備3．稀釋血清4．病毒中和抗體測定的操作步驟中和實驗的檢測原理5．結果判定三、實驗室檢測操作流程41（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度比較患者急性期血清與恢復期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學診斷方法，最常用的是中和實驗，即用微量板法測定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測定血清中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清與恢復期血清滴度進行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，腸道病毒隱性感染也很常見，所以在評估檢測結果時就要小心一些。在中和實驗中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，三、實驗室檢測操作流程42（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度CVA16原型株為G-10株）或流行株，有時同時（或單獨）使用臨床分離株會有助于得到更準確的檢測結果。使用對腸道病毒敏感的細胞，如RD細胞。用病毒（血清）稀釋液（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因為是用病毒來確定血清中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準確的檢測結果，但分離株的滴度（100CCID50/0.05ml）要事先測定。三、實驗室檢測操作流程43（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度中和實驗的檢測原理：病毒感染敏感靶細胞后，引起細胞形態學變化，出現CPE，特異性中和抗體與病毒結合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現。1．液體配制三、實驗室檢測操作流程44（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度A液：血清處理液：（100ml中含下列試劑成份）B液：細胞營養液：（按生長液配方配制，100ml中含下列試劑成份）

C液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體）MEM85ml85ml93ml3%L-谷氨酰胺1ml1ml1ml7.5%碳酸氫鈉2ml2ml2ml

HEPES 1ml1ml胎牛血清2ml10ml2ml青、鏈霉素（各10000U/ml）10ml1ml1ml三、實驗室檢測操作流程45（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備（1）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于10支凍存管中，每管1.5ml，一般每管應在一次試驗中用完，有剩余應高壓后廢棄；（2）加Eagle液10倍系列稀釋為10-1至10-8病毒液，各加入細胞板內，每孔50μl，每稀釋度4孔細胞；（3）每孔加細胞懸液50μl，同時設細胞對照（50μl稀釋液+50μl細胞懸液），36℃培養7d，觀察細胞病變；（4）按Behrens-K?rber公式計算出分離病毒株的CCID50；三、實驗室檢測操作流程46（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度logCCID50=L-d(S-0.5)，其中：L=實驗中使用的最低稀釋度的對數值；d=稀釋梯度的對數值；S=終判時陽性部分的總和（即出現CPE的細胞孔所占的比例之和）。（5）正式試驗前應先滴定攻擊病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100CCID50的病毒載量；（6）按照計算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗所需的病毒總量（即100CCID50/0.05ml）；三、實驗室檢測操作流程47（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度（7）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）0.9ml；（8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經稀釋好的攻擊病毒液（即100CCID50/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1CCID50/0.05ml和0.1CCID50/0.05ml。三、實驗室檢測操作流程48（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度3．稀釋血清（1）發病1-3d內采取患者急性期血清，發病后2-4周采取恢復期血清，分別凍存在-20℃備檢。（2）取無菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml，加待測血清0.1ml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過夜，即為1：4稀釋血清。次日56℃、30min滅活。（3）打開獨立無菌包裝48孔組織培養板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。三、實驗室檢測操作流程49（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度使用移液器吸取處理過的血清0.1ml加入第一孔（即為1:16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即為1:64），依次至1:1024，血清稀釋的過程中不必更換吸尖。即每份血清標本進行4倍倍比稀釋，即1:4、1:16、1:64、1:256、1:1024。（4）每份血清標本的每個稀釋度都要平行做兩孔。4．病毒中和抗體測定的操作步驟：（1）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對）待測血清，版面設計如下圖所示。三、實驗室檢測操作流程50（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀釋度的待測血清0.05ml，不必更換吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀釋度的待測血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀釋度的待測血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀釋度的待測血清0.05ml，三、實驗室檢測操作流程51（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀釋度的待測血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）為每份待測血清對照孔，每孔中補加稀釋液0.05ml；（2）上述孔中分別加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已經稀釋為100CCID50/0.05ml）；（3）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃CO2孵箱中孵育2h；三、實驗室檢測操作流程52（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度

三、實驗室檢測操作流程53（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度（4）另取一塊96孔板縱向使用，做100CCID50/0.05ml病毒滴度的核實（每次實驗都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）0.05ml，然后從0.1CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每個稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100CCID50/0.05ml；同時留出4孔做為細胞對照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4℃冰箱中暫存；三、實驗室檢測操作流程54（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度三、實驗室檢測操作流程55（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度（5）在孵育期間，用消化液消化細胞，準備細胞懸液，細胞懸液的濃度為2×105個/ml，每塊96孔板至少需要準備10ml；（6）孵育結束后每個待測血清孔、血清對照孔（待檢標本板）和病毒回滴孔和細胞對照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36℃CO2孵箱中孵育培養；（7）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結果，以不產生細胞病變的血清最高稀釋度的倒數為終點效價。當100CCID50/0.05ml的病毒對照孔出現完全病變時，判定最終結果（約5~7d）；（8）注意：如果病毒對照結果（病毒回滴）不在32~320CCID50/0.05ml的范圍內，實驗無效，就要重復實驗。三、實驗室檢測操作流程56（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度5．結果判定當最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現細胞病變，另一孔不出現細胞病變，該稀釋度的倒數計即為該血清標本的中和抗體效價；當高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數即為該血清標本的中和抗體效價；當兩個相鄰稀釋度血清均出現1孔細胞病變，另1孔不出現細胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數即為該血清標本的中和抗體效價。三、實驗室檢測操作流程57（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度對于HFMD的雙份血清中和實驗結果來說，如果恢復期血清較急性期血清EV71或CVA16中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關實驗證實；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽性。三、實驗室檢測操作流程58（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）2．逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）3．電泳分析4．結果解釋1．RNA提取三、實驗室檢測操作流程59（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）1．RNA提取可使用多種商業化試劑盒來提取RNA，針對臨床標本應選擇質量較高的“用于臨床標本病毒RNA提取的試劑盒”，也可使用全自動RNA提取儀進行提取。針對病毒分離物，核酸提取比較容易，大部分商業化RNA提取試劑盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依據使用的試劑不同，嚴格按說明書進行操作。三、實驗室檢測操作流程60

2．逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）（2）實驗設計（3）RT-PCR擴增反應和條件（1）引物序列合成三、實驗室檢測操作流程61（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）2．逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）（1）引物序列合成國家脊灰實驗室自行設計3對引物，分別為人腸道病毒通用引物、EV71特異性引物和CVA16特異性引物。各省CDC依據引物序列在質量有保證的公司合成,引物合成后,需要做預實驗，保證引物合成沒有質量問題后,分發給地市級CDC。三、實驗室檢測操作流程62（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）1）人腸道病毒（包括EV71、CVA16）核酸檢測通用引物序列：PE2（上游）：5`-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3`PE1（下游）：5`-ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTCC-3`三、實驗室檢測操作流程63（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）2）EV71核酸檢測引物序列：EV71-S（上游）：5`-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`EV71-A（下游）：5`-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`三、實驗室檢測操作流程64（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）3）CVA16核酸檢測引物序列：CVA16-S（上游）：5`-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3`CVA16-A（下游）；5`-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3`三、實驗室檢測操作流程65（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）（2）實驗設計1）在PCR記錄紙（實驗記錄紙）上記錄本次實驗操作者姓名，實驗日期，所鑒定標本的名稱以及標本的順序，與PCR儀排列的順序一致。2）標記好加標本和對照的PCR管（陽性對照，陰性對照和試劑對照）。A：陽性對照：參比RNA，省級CDC提供（只是在初次使用，常規不建議使用，以防污染）。三、實驗室檢測操作流程66（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）B：陰性對照：使用正常細胞RNA或臨床標本腸道病毒陰性的RNA（每次實驗要設立）。C：試劑對照：用去離子水代替標本（試劑初次使用時必須做）。三、實驗室檢測操作流程67（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）

（3）RT-PCR擴增反應和條件1）從臨床標本或病毒中提取的RNA和各種RT-PCR試劑應該一直放在冰浴盒上；2）配下列試劑主溶液：

10×PCRBuffer·····························································5.0μldNTPs（2.5mMeach）···················································2.0μl上游引物（0.1μg/μl）····················································1.0μl下游引物（0.1μg/μl）····················································1.0μlRNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）······································0.5μlTaqDNA聚合酶（5U/μl）···············································0.5μlAMV逆轉錄酶（10U/μl）················································1.0μl模板RNA·······································································3.0μlRNaseFreedH2O··························································36.0μl50.0μl三、實驗室檢測操作流程68（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）3）在PCR儀上進行RT-PCR反應，反應步驟如下：42℃························45min95℃························3min95℃··················20s45℃··················25s

×32個循環72℃························30s72℃························10min4℃························Soak三、實驗室檢測操作流程69（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）3．電泳分析（1）將已經聚合的3%的瓊脂糖凝膠放在電泳裝置上；（2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6×電泳載樣緩沖液（每個反應需1μl）。再加上5μl的PCR反應產物與之混合；（3）將電泳緩沖液倒在電泳裝置中，用吸尖將樣品與載樣緩沖液的混合溶液加到孔中；（4）蓋上蓋子，接通電源，以10V/cm電壓（恒定電壓）電泳，大約35-40min，直到溴酚藍跑到凝膠的底部的時候，停止電泳；三、實驗室檢測操作流程70（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）（5）將膠取出，并注意保持凝膠的方向；（6）在1μg/ml的溴化乙錠溶液中染色15min；（注意：溴化乙錠溶液是有毒、致畸、并且致腫瘤的物質，操作時要加小心，并戴雙層手套。如果儲存在避光的容器中，溴化乙錠溶液可以重復使用。溴化乙錠廢棄物按醫療廢棄物中化學品的有關規定處理。）（7）在蒸餾水中涮一下凝膠；（8）在紫外透射儀下觀察PCR產物電泳結果，并照相作記錄。有條件的實驗室可以使用全自動電泳分析儀。三、實驗室檢測操作流程71（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）4．結果解釋使用全自動電泳分析儀的實驗室可以通過儀器自動讀取PCR產物大小，來判斷結果。通過瓊脂糖凝膠做PCR產物電泳的實驗室，需要參照DNA分子量對照對照，比較標本的PCR產物與陽性對照的PCR產物在凝膠上的位置以及大小來解釋結果。三、實驗室檢測操作流程72RT-PCR實驗結果解釋表待檢標本RT-PCR結果鑒定結果HEV(-),EV71(-),CVA16(-)非腸道病毒（NEV）HEV(+),EV71(-),CVA16(-)非EV71、CVA16的其它腸道病毒HEV(+),EV71(+),CVA16(-)EV71HEV(+),EV71(-),CVA16(+)CVA16三、實驗室檢測操作流程73(四)Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）2.Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）（1）OneStepReal-timePCR法檢測EV71病毒核酸（單通道檢測）（2）OneStepReal-timePCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）1.病毒核酸提取三、實驗室檢測操作流程74(四)Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）1.病毒核酸提取參考常規RT-PCR病毒核酸提取步驟和注意事項。2.Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）依據不同廠家的試劑盒，嚴格按相應說明書操作和判斷結果。有5種試劑盒，分別為OneStepReal-timePCR法檢測EV71病毒核酸（單通道檢測）；OneStepReal-timePCR法檢測CVA16核酸（單通道檢測）；OneStepReal-timePCR法檢測腸道病毒核酸（單通道檢測）；三、實驗室檢測操作流程75(四)Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）OneStepReal-timePCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）；OneStepReal-timePCR法同時檢測EV71和腸道病毒核酸（雙通道檢測）。下面舉2個例子來說明單通道檢測和雙通道檢測的操作規程和注意事項。（1）OneStepReal-timePCR法檢測EV71病毒核酸（單通道檢測）①反應體系配置：反應體系共25μl，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5μl的RNA模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應體系及條件隨之變化。三、實驗室檢測操作流程76(四)Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）a.從試劑盒中取出相應的試劑，反應液在室溫融化后，瞬時離心，按n+1配置反應體系（n=樣本數+1管陽性對照+1管陰性對照），每個測量反應體系配置如下表：試劑組成1份樣品的量熒光RT-PCR反應液12.5μl逆轉錄酶0.5μlTaq酶0.5μl引物和探針1.5μlH2O5μl三、實驗室檢測操作流程77(四)Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）b.將上述反應液混勻離心后，按照每管20μL分裝于各熒光PCR儀適用的PCR管中。c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應管中，模