第六章高效液相色譜一、高效液相色譜儀二、液相色譜檢測器三、影響分離的因素四、高效液相色譜法的主要分離類型學習內容一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜動畫：

液相色譜的

液相色譜原理與流程.swf一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜1.高效液相色譜儀的系統組成一高效液相色譜儀流動相進樣閥注入樣品液色譜柱檢測器色譜處理機高壓泵流出液高壓輸液系統進樣系統分離系統檢測和記錄系統控溫系統第六章高效液相色譜1.

高效液相色譜儀的系統組成一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜1.高效液相色譜儀的系統組成一高效液相色譜儀a)取樣位（load）b)進樣位（injection）第六章高效液相色譜(1)進樣裝置1.高效液相色譜儀的系統組成一高效液相色譜儀（a）手動進樣閥在INJECT

位置：把取存試液的進樣針導入進樣孔，直到插入為止（必須穿過轉子密封圈聚四氯乙烯套管）；（b）轉動手柄到LOAD位置：把試液放入閥體中的定量環里；（c）同時轉動手柄到INJECT位置：試液進入液路。正確的進樣方式第六章高效液相色譜1.高效液相色譜儀的系統組成一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜動畫：

六通閥進樣器

高效液相色譜進樣裝置1.高效液相色譜儀的系統組成一色譜儀進樣前樣品處理及注意事項（a）須用專用平頭液相專用注射器進樣（禁用氣相尖頭進樣針）；（b）進樣試液應無顆粒、渾濁和乳化，使用前先用超聲波溶解后，須用0.45um的過濾膜過濾；（c）部分裝取樣時，取樣體積一般小于定量環的50%，完全裝液，相取樣體積取必須是定量環的5倍以上（特別是高要求分析中外標定量）；（d）如流動相使用緩沖鹽（或酸性、堿性）在使用結束時必須用蒸溜水在load和INJECT

位置反復沖洗干凈，因鹽析出會損害轉子、定子密封圈；一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜1.高效液相色譜儀的系統組成一色譜儀一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜(2)高壓輸液泵

高壓輸液泵為主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。高壓輸液泵應具有壓力平穩、脈沖小、流量穩定可調、耐腐蝕等特性。1.高效液相色譜儀的系統組成一色譜儀一高效液相色譜儀動畫：單柱塞泵動畫往復式柱塞泵動畫往復泵結構與原理

單柱塞泵輸出液體流量脈動不利于色譜分析第六章高效液相色譜(2)高壓輸液泵1.高效液相色譜儀的系統組成一色譜儀一高效液相色譜儀串聯雙柱塞泵◆單向閥的沾污是恒流泵輸液性能下降的主要原因，單向閥越少，發生故障的機會也越小。串聯式補償結構的高壓泵流量精度高，壓力波動小，更換溶劑方便，易于清洗，很適合于梯度淋洗。第六章高效液相色譜1.高效液相色譜儀的系統組成一色譜儀一高效液相色譜儀

外梯度：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。第六章高效液相色譜(3)梯度淋洗裝置1.高效液相色譜儀的系統組成一色譜儀一高效液相色譜儀

內梯度：一臺高壓泵，通過比例調節閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第六章高效液相色譜(3)梯度淋洗裝置1.高效液相色譜儀的系統組成一色譜儀一高效液相色譜儀

色譜柱是色譜儀的心臟（起分離作用），其核心是優質固定相（填料）。進行色譜分離的首要工作是選擇性能良好的色譜柱，即在確定的分離條件下分離效率高和分析時間短的色譜柱。發展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。第六章高效液相色譜(4)高效分離柱1.高效液相色譜儀的系統組成一色譜儀一高效液相色譜儀第六章高效液相色譜(5)高效液相色譜法的特點

特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩定有機及生化試樣的高效分離分析方法。一色譜儀1.檢測器類型二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜示差折光檢測器（折光指數檢測器）（RID）蒸發光散射檢測器（ELSD）紫外檢測器（UVD）二級管陣列檢測器（DAD）熒光檢測器（FLD）一色譜儀二液相色譜檢測器2.紫外檢測器第六章高效液相色譜

紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測器。

動畫：紫外光度檢測器一色譜儀3.光電二極管陣列檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖。一色譜儀3.光電二極管陣列檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜反相光路系統：從光源發出的光通過透鏡進入檢測池，通過檢測池的光線由光導纖維傳遞，凹面全息光柵分光后，經過二級管陣列和放大電路、控制電路進行信號處理。動畫：二極管陣列檢測器一色譜儀3.光電二極管陣列檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜反相光路系統：從光源發出的光通過透鏡進入檢測池，通過檢測池的光線由光導纖維傳遞，凹面全息光柵分光后，經過二級管陣列和放大電路、控制電路進行信號處理。DAD檢測器的反相光路系統UV檢測器的光學系統一色譜儀3.光電二極管陣列檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜常規色譜圖與三維色譜圖光譜圖一色譜儀3.光電二極管陣列檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜典型三維液相色譜圖（吸光度－波長－時間）一色譜儀3.光電二極管陣列檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜

二級管陣列檢測器在復雜樣品檢測方面具有獨特的優勢，隨著高效液相色譜在天然產物、中醫藥、環境、化工等領域復雜樣品的分析研究中應用越來越廣，二級管陣列檢測器也越來越顯示出它的重要性。一色譜儀4.熒光檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜

熒光檢測器的最大優點是具有極高的檢測靈敏度和良好的選擇性。一般來說，FLD比UV的靈敏度要高10～1000倍，可用于低至ng/ml級定量分析。

FLD對痕量分析與復雜樣品基質都很理想，在藥物和生化分析中有廣泛應用。應用于受紫外光照射后能發射出熒光的物質，特別是芳香族化合物、生化物質，如有機胺、維生素、激素、酶等的分析。一色譜儀4.熒光檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜

熒光檢測器用于檢測：本身具有熒光的物質；無熒光的物質衍生成的熒光體（借助色譜衍生技術）。一色譜儀5.示差折光檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜

除紫外檢測器之外應用最多的檢測器；可連續檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數差值。差值與濃度呈正比，屬于濃度敏感型檢測器。特點：通用型檢測器（每種物質具有不同的折光指數）；靈敏度低，對流動相流量變化敏感，不適用于痕量分析；對壓力和溫度變化很敏感，折光物質由于溫度變化引起該物質密度的變化，進而導致折射率的改變。RID使用時溫度變化要保持0.001℃范圍內；不能用于梯度洗脫，因為它對流動相組成的任何變化都有明顯的響應，會干擾被測樣品的檢測。結構分為：偏轉式、反射式和干涉型三種。動畫：偏轉式示差折光檢測器一色譜儀6.蒸發光散射質量檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜HPLC的發展中受到限制的一個原因,就是缺少象GC中的FID一樣的靈敏、通用型的檢測器。20世紀80年代后研制的蒸發光散射質量檢測器給這一領域帶來希望，并向具有真正通用型意義的檢測器方向發展。即：樣品結構不需要具備紫外發色團和合適的折射率；對梯度洗脫和流動相系統的溫度變化不敏感；對各種物質的響應因子很接近；在一次分析中可以同時檢測主要成分和雜質。一色譜儀6.蒸發光散射質量檢測器二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜ELSD的工作原理：經色譜柱分離的組分隨流動相進入霧化器，被高速的載氣流（氦氣和空氣）噴成一種薄霧。這些霧粒進入可控制溫度的蒸發器（漂移管）中，使流動相氣化蒸發，溶劑蒸發后剩下的不揮發組分成為微小的霧狀顆粒，進入光散射室進行檢測。光源光線經準直后成直角方向通過氣流，然后被光阱捕集，以防止反射。蒸氣狀態溶劑通過光路時，光線反射到檢測器上成為穩定的基線信號。云霧狀溶質顆粒通過光路時，被位于入射光束1200角的檢測器收集。一色譜儀二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜流動相霧化氣體霧化器漂移管霧化蒸發檢測一色譜儀二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜6.蒸發光散射質量檢測器優缺點：

與示差折光檢測器相比：靈敏度高；對流動相系統溫度變化不敏感；可進行梯度洗脫。

與紫外－可見光吸收檢測器相比：能解決最困難的HPLC檢測問題。如磷脂、皂甙、糖類、聚合物、樹脂等無紫外吸收或紫外吸收系數很小的化合物的檢測；理論上可用于揮發性低于流動相的任何組分的檢測，擴大了HPLC的應用范圍；減低流動相溶劑的純度要求；無需測定定量校正因子；但靈敏度低于紫外檢測器。一色譜儀二液相色譜檢測器第六章高效液相色譜7.質譜檢測器目前質譜儀種類有：磁偏轉式質譜四極桿式質譜(Q-MS)

離子阱式質譜(IT-MS)

飛行時間質譜(TOF-MS)

傅里葉變換離子回旋共振質譜(FTICR-MS)

其中LC-TOFMS最具發展前景。一色譜儀三影響分離的因素第六章高效液相色譜

在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，而只有兩項，即：

H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示：

影響分離的主要因素有流動相的流量、性質和極性。一色譜儀三影響分離的因素第六章高效液相色譜1.流速

流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調整分離度和出峰時間的重要可選擇參數。

多選粘度小、低流速的流動相——甲醇，約1ml/min一色譜儀三影響分離的因素第六章高效液相色譜2.固定相與分離柱

氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細內徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領域。一色譜儀三影響分離的因素第六章高效液相色譜3.流動相與流動相的極性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。一色譜儀三影響分離的因素第六章高效液相色譜3.流動相與流動相的極性

流動相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:

己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調節流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。流動相組成一色譜儀三影響分離的因素第六章高效液相色譜3.流動相與流動相的極性選擇流動相時應注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜1.吸附色譜（液-固吸附色譜）

以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。

分離原理：溶質分子和流動相分子在吸附劑表面呈現的吸附活性中心上進行競爭吸附，便形成不同溶質在吸附劑表面的吸附、解吸平衡，這就是液固吸附色譜具有選擇性分離能力的基礎。一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜1.吸附色譜（液-固吸附色譜）優點：柱填料（固定相）價格便宜；對樣品的負載量大；在pH＝3～8范圍內固定相的穩定性較好。

凡能夠用薄層色譜法成功分離的混合物，都可以用液-固色譜法分離；缺點：

非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜2.分配色譜（液-液分配色譜）

早期通過在擔體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現多為化學鍵合固定相，即用化學反應的方法通過化學鍵將固定液結合在擔體表面。由于采用化學鍵合固定相使固定液與擔體之間形成化學鍵，避免涂漬的固定液流失。

最常見化學鍵合類型，熱穩定好，不易吸水，耐有機溶劑。能在70℃以下，pH2～8范圍內正常工作，應用廣泛。一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜2.分配色譜（液-液分配色譜）一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜2.分配色譜（液-液分配色譜）1）適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學鍵合反應，可以把不同的有機基團鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過改變流動相的組成和種類來有效地分離非極性、極性和離子型化合物。

2）由于鍵合到載體上的基團不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復雜體系的分離創造了條件。

3）鍵合固定相對不太強的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學穩定性和熱穩定性。

4）固定相柱效高，使用壽命長，分析重現性好。化學鍵合固定相的優點：一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜但傳統的離子交換色譜存在著兩個難于解決的問題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時間很長；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的再線檢測方法。

固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜

離子色譜以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象,在20世紀70年代出現、80年代迅速發展。

在傳統的離子交換色譜基礎之上發展了離子色譜儀。一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；細顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液；在分離柱后，用另外一支抑制柱來消除淋洗液的高本底電導；采用電導檢測器檢測流出組分。快速分離分析微量無機離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現，發展迅速。一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜基本原理：組分在固定相上發生的反復離子交換反應；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。親和力大，保留時間長；

陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-應用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Temporalcourse離子交換分離機理ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜陰離子交換樹脂分離陰離子Column：IonPac

AG12A/AS12A

Eluent：2.7mMNa2CO30.3mMNaHCO3

Flowrate：1.2mL/minDetection：Conductivity

(ASRSRecyclemode)

0246810121416Retentiontime(min)08mSF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜Column: IonPacCS12A,CG12AEluent: 20mMMethanesulfonicacidFlowrate: 1.0mL/minDetection: Conductivity

（CSRSRecyclemode)

02468101214Retentiontime(min)01234Na+NH4+K+Mg2+Ca2+μS陽離子交換樹脂分離陽離子一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜（1）分析速度快

可在數分鐘內完成一個試樣的分析；（2）分離能力高在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）儀器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蝕一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜抑制型：抑制柱型、連續抑制型

分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在0.01～0.05毫摩爾/克干樹脂。非抑制型:

當進一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.007～0.07毫摩爾/克干樹脂),使用低濃度、低電離度的有機弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜3.離子交換色譜動畫：

離子交換色譜、離子交換分離、離子交換層析一色譜儀四液相色譜主要分離類型第六章高效液相色譜4.凝膠色譜（空間排阻色譜）

以凝膠為固定相。凝膠是一種經過交聯的、具有立體網狀結構和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質凝膠。

原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠