植物組織培養(yǎng)學(xué)Planttissueculture

2021年春學(xué)期阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院QQ群1109539732024/1/82第四章植物器官培養(yǎng)第一節(jié)概述

第二節(jié)營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng)第三節(jié)繁殖器官培養(yǎng)

2024/1/83植物器官培養(yǎng)〔OrganCulture〕是指對(duì)植物某一器官的全部、局部或器官原基進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。分為營(yíng)養(yǎng)器官〔根、莖、葉〕和繁殖器官〔胚胎、種子、花器官〕培養(yǎng)。第一節(jié)概述2024/1/84植物器官培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng)繁殖器官培養(yǎng)根培養(yǎng)莖培養(yǎng)（包括莖尖、莖段）葉培養(yǎng)（包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉）花培養(yǎng)（包括花托、花瓣、花絲、花柄、子房、花藥）種子培養(yǎng)（包括成熟與未成熟）胚胎培養(yǎng)（包括幼胚、成熟胚、胚珠、子房、胚乳培養(yǎng)）外植體形態(tài)發(fā)生形成完整植株的途徑〔一〕外植體-愈傷組織-完整植株。具體又可分為三種：1、愈傷組織-同時(shí)長(zhǎng)芽和根-植株。2、愈傷組織-莖-根-植株。3、愈傷組織-根-芽-植株。4、愈傷組織-體細(xì)胞胚-植株第二節(jié)營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng)2024/1/87一、離體根的培養(yǎng)二、莖尖的培養(yǎng)*三、莖段的培養(yǎng)四、離體葉的培養(yǎng)*一、離體根的培養(yǎng)〔一〕意義：①生理代謝研究的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)體系②研究器官分化形態(tài)建成的良好體系③建立快速生長(zhǎng)的根無(wú)性系④進(jìn)行誘變育種2024/1/881.培養(yǎng)基選擇White培養(yǎng)基；2/3或1/2MS和B5培養(yǎng)基注：離體根生長(zhǎng)要求提供全部必需元素，蔗糖、硝態(tài)氮效果好，參加VB1、VB6最重要，生長(zhǎng)素對(duì)離體根影響不一致。培養(yǎng)溫度25－27℃，暗光培養(yǎng)。2024/1/89〔二〕培養(yǎng)方法離體根生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求1、無(wú)機(jī)成分要求培養(yǎng)基中有全部必要元素，因?yàn)樗请x體生長(zhǎng)所需要的，一般的為MS、B5培養(yǎng)基。2、氮源氮源有銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和可溶性有機(jī)氮如氨基酸或酰胺等，其中以硝態(tài)氮的效果最好。參加含各種氨基酸的水解酪蛋白，能促進(jìn)離體根的生長(zhǎng)。3、碳源以蔗糖的效果最正確，幾乎為葡萄糖的10倍。蔗糖的濃度為2—3%。4、維生素維生素以B1和B6最為重要，缺少它根的生長(zhǎng)受到阻礙，而參加它可使根的生長(zhǎng)成倍的加快。B1的使用濃度為為宜。5、生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)離體根的生長(zhǎng)而言，生長(zhǎng)素的效應(yīng)最為明顯，在一般情況，參加適量的生長(zhǎng)素能促進(jìn)根的生長(zhǎng)，其反響和需要量因植物種而異：6、溫度和光照黑暗有利于根的形成，溫度一般在16-25℃7、PH根發(fā)生和生長(zhǎng)所需的PH范圍一般為2.無(wú)性繁殖系的建立

種子消毒→→接種→→待根伸長(zhǎng)后從根尖一端切取長(zhǎng)1.2cm的根尖→→接種于培養(yǎng)基→→發(fā)育出側(cè)根→→待側(cè)根生長(zhǎng)約1周后切取側(cè)根的根尖進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)→→又迅速生長(zhǎng)并長(zhǎng)出側(cè)根→→切下進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)→→得到從單個(gè)根尖衍生而來(lái)的離體根的無(wú)性系。

3.培養(yǎng)條件

暗光和溫度25-27℃。2024/1/8124、根的間接增殖第一步在脫分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，如胡楊的根段培養(yǎng)，可誘導(dǎo)形成白色愈傷組織。第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成芽的分化，如胡楊從綠色愈傷組織分化出小植株。一、離體根的培養(yǎng)

胡蘿卜根培養(yǎng)5、培養(yǎng)方式離體根的培養(yǎng)方式有三種類型。第一種固體培養(yǎng)法，即將根尖接種在固體培養(yǎng)基上，根依靠培養(yǎng)基中的養(yǎng)分和生長(zhǎng)物質(zhì)而不斷生長(zhǎng)。第二種是液體培養(yǎng)法，把根尖接種在無(wú)瓊脂的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)常振蕩使根獲得充足的氧氣。第三種是固體-液體培養(yǎng)法，就是把根基部插入固體瓊脂培養(yǎng)基中，根尖浸在液體培養(yǎng)基中，根尖生長(zhǎng)而根不斷的伸長(zhǎng)和分枝。2024/1/816二、莖尖的培養(yǎng)*〔一〕莖尖培養(yǎng)概念及類型〔二〕病毒在植物體內(nèi)的分布〔三〕莖尖培養(yǎng)方法及步驟(一)莖尖培養(yǎng)概念及類型莖尖培養(yǎng)：切取莖的先端局部或莖尖分生組織局部，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)目的和取材大小可分為：①微莖尖培養(yǎng):帶有1-2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)點(diǎn),其長(zhǎng)度不超過(guò)0.5mm。

2024/1/817②普通莖尖培養(yǎng)：較大的莖尖(如幾mm到幾十mm)、芽尖及側(cè)芽。這里主要講普通莖尖培養(yǎng)。這種培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單，操作方便，莖尖容易成活，成苗所需時(shí)間短。莖尖培養(yǎng)的意義：普通莖尖培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單，操作方便，易成活，成苗時(shí)間短，加快繁殖。微莖尖培養(yǎng)可獲得脫毒苗；2024/1/818病毒侵染植株的葉片后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，即向附近的細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移速度很慢，每小時(shí)只有幾微米。當(dāng)葉片內(nèi)病毒濃度增大到一定量時(shí)，就轉(zhuǎn)移到韌皮部，隨后通過(guò)維管束轉(zhuǎn)移到其它局部。由于病毒轉(zhuǎn)移速度慢，加上莖尖分生組織無(wú)維管束，病毒只能通過(guò)胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的速度，所以生長(zhǎng)點(diǎn)的病毒數(shù)量極少，幾乎檢測(cè)不出。莖尖培養(yǎng)時(shí)，切取的莖尖越小，帶病毒的可能性就越小。——莖尖脫毒的根本原理(二)病毒在植物體內(nèi)的分布〔三〕莖尖培養(yǎng)方法及步驟2024/1/821取材材料處理及消毒培養(yǎng)接種馴化移栽①直接取材：在生長(zhǎng)旺盛、枝條健壯、無(wú)病的母株上選生長(zhǎng)不久、雜菌污染少的頂梢〔1－2cm〕〔取前可噴殺菌藥，可頂芽或側(cè)芽〕。②從試管苗獲取。2024/1/8221、取材取1-2㎝頂梢2024/1/8232、材料處理及消毒將采集到的莖尖切成長(zhǎng)→→去葉〔休眠芽預(yù)先剝除鱗片〕→→流水沖洗2-4h→→75％的酒精中處理30s→→稀釋20倍的次氯酸鈉中浸5-8min(取自老枝條上的可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間〕→→用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，準(zhǔn)備接種。

3、接種

接種前再剝掉一些葉片，使莖尖0.5cm→→接種要求：隨切隨接，動(dòng)作迅速。亦可將切下莖尖材料在1－5%VC液中浸一下。2024/1/8244、培養(yǎng)的方法和程序〔1〕培養(yǎng)基①根本培養(yǎng)基MS、White、B5、Heller培養(yǎng)基。②蔗糖作碳源效果好，濃度2－3%。③激素〔2，4-D，IAA，NAA〕和有機(jī)添加物有明顯影響。但激素濃度以0.1mg/L為宜，不要太高。2024/1/825生長(zhǎng)太慢：莖尖不增大→→變綠→→細(xì)胞逐漸老化→→休眠原因:生長(zhǎng)素濃度太低；溫度過(guò)低或過(guò)高；生長(zhǎng)太快：莖尖迅速增大→→愈傷組織→→喪失成苗能力原因:生長(zhǎng)素濃度過(guò)高；光照太弱或溫度太高；生長(zhǎng)正常：莖尖基部稍增大并形成少量愈傷組織，莖尖顏色逐漸變綠，并伸長(zhǎng)，葉原基發(fā)育成可見(jiàn)的小葉，進(jìn)而形成小苗。2024/1/826莖尖生長(zhǎng)狀態(tài)〔2〕初代培養(yǎng)條件每天光照16h，光強(qiáng)度1500-30001x，溫度25±2℃2024/1/827〔3〕繼代培養(yǎng)莖尖長(zhǎng)成的新梢→→切成小段→→增殖培養(yǎng)基中→→1個(gè)月左右→→新梢又可切成小段→→再轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基→→建立和維持了莖尖無(wú)性系。〔即微型扦插〕

繼代培養(yǎng)可用MS培養(yǎng)基。2024/1/828〔4〕誘導(dǎo)生根采用1／2MS培養(yǎng)基參加一定的生長(zhǎng)素類調(diào)節(jié)物質(zhì)，如NAA、IBA等。新梢基部浸入50或100mg/l的IBA溶液處理4-8h，然后轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的生根培養(yǎng)基中。2024/1/829(5)馴化移栽入土在生根培養(yǎng)1個(gè)月左右→→生長(zhǎng)健壯而興旺的根系→→煉苗→→移栽→→管理〔溫、光、濕、氣〕2024/1/830指不帶芽和帶一個(gè)以上定芽或不定芽〔包括塊莖、球莖在內(nèi)〕的幼莖切段的無(wú)菌培養(yǎng)。2024/1/831三、莖段培養(yǎng)莖段培養(yǎng)用于快速繁殖的優(yōu)點(diǎn)培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單易行，繁殖速度較快，每年可增殖105-1012株苗；加速良種和珍貴植物的繁殖，芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無(wú)病，性狀均一；解決不能用種子繁殖的無(wú)性繁殖植物的快速繁殖的問(wèn)題，且可節(jié)省種株；試管苗便于運(yùn)輸和防止種苗帶菌傳播，有利于國(guó)際種質(zhì)交流；試管苗可用于保存某些難以用種子保存的種質(zhì)資源。〔一〕定義：離體葉培養(yǎng)指包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉在內(nèi)的葉組織的無(wú)菌培養(yǎng)。它大多經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再由愈傷組織分化出芽和根。其中葉片培養(yǎng)是一個(gè)典型的代表。

2024/1/833四、離體葉的培養(yǎng)*〔二〕意義：1.是繁殖稀有名貴品種的有效手段；2.可用于研究形態(tài)建成、光合作用、葉綠素形成等理論問(wèn)題。2024/1/834〔三〕葉片的離體培養(yǎng)方法發(fā)育方式：葉片培養(yǎng)再生成完整植株有兩種方式：①是直接誘導(dǎo)形成芽和根→→完整植株；②是先誘導(dǎo)形成愈傷組織，再經(jīng)愈傷組織分化形成芽和根→→完整植株。其中，以第二種方式最為常見(jiàn)。2024/1/835葉片離體培養(yǎng)發(fā)育方式〔成苗途徑〕2024/1/836葉原基葉鞘葉片子葉葉柄愈傷組織芽和根試管苗

不定芽1.材料選擇及滅菌取植物的幼嫩葉片，切割成適當(dāng)大小〔2—3cm〕，在流水中沖洗干凈。再用75％酒精浸泡約10s→→飽和漂白粉液中浸3-15min，或在0.1％升汞中浸3-5min→→無(wú)菌水沖洗數(shù)次→→無(wú)菌的干濾紙上吸干水分→→接種。注：細(xì)嫩與成熟葉片消毒時(shí)間不同2024/1/8372.接種

外植體大小：0.5cm2薄片〔葉柄、子葉〕上表皮朝上接種培養(yǎng)基。最好帶葉脈，注意極性2024/1/8383.培養(yǎng)〔1〕培養(yǎng)基：MS、B5、White、N6；蔗糖3%；2.4－D利于愈傷組織形成，NAA抑制芽形成，利于根發(fā)生，KT、6-BA利于芽形成。愈傷組織誘導(dǎo)：BA1-3mg/L,NAA0.25-1mg/L；分化培養(yǎng)：CTK2mg/L；生根培養(yǎng)：NAA0.5－1.0mg/L2024/1/839(2)培養(yǎng)過(guò)程：

培養(yǎng)約2周至4周→→形成愈傷組織→→再分化培養(yǎng)基上〔附加6-BA2mg／L〕進(jìn)行分化培養(yǎng)→→約10d左右，愈傷組織開(kāi)始轉(zhuǎn)綠出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)→→發(fā)育成無(wú)根苗→→生根培養(yǎng)基〔附加NAA0.5-lmg/L〕→→發(fā)育形成完整植株。2024/1/840(3)培養(yǎng)條件：

溫度：25±2℃

光照時(shí)間：10-12h，光照強(qiáng)度：1500-3000Lx。2024/1/841

葉的培養(yǎng)比胚，莖尖和莖段培養(yǎng)難度大。首先要選用易培養(yǎng)成功的葉組織，如幼葉比成熟葉易培養(yǎng)，子葉比葉片易培養(yǎng)。其次要添加適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，保證利于葉組織的脫分化和再分化。2024/1/842第三節(jié)生殖器官的培養(yǎng)2024/1/843一、花器官的培養(yǎng)二、種子的培養(yǎng)三、胚胎的培養(yǎng)*2024/1/844一、花器官的培養(yǎng)1.定義：花器官培養(yǎng)指整個(gè)花器及其組成局部如花托、花瓣、花絲、花柄、子房、花藥等的無(wú)菌培養(yǎng)。2024/1/845一、花器官的培養(yǎng)〔花蕾〕2、意義：通過(guò)離體花芽培養(yǎng)可了解整體植物和內(nèi)源激素在花芽性別決定中所起的作用可以了解花器各局部對(duì)果實(shí)和種子發(fā)育的作用內(nèi)、外源激素在果實(shí)種子發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用生產(chǎn)上也可用于珍貴品種的擴(kuò)大繁殖。2024/1/8462024/1/847二、種子培養(yǎng)2024/1/848定義：

種子培養(yǎng)是指受精后發(fā)育完全的成熟種子和發(fā)育不完全的未成熟種子的無(wú)菌培養(yǎng)。2.意義：可以打破種子休眠，促進(jìn)萌發(fā)；通過(guò)胚胎拯救解決遠(yuǎn)緣雜種敗育性，產(chǎn)生后代；快速繁殖苗木優(yōu)點(diǎn)：植株分化容易，無(wú)菌操作方便2024/1/849

定義：植物胚胎培養(yǎng)是指對(duì)植物的胚(幼胚、成熟胚)、子房、胚珠和胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。2024/1/850三、胚胎的培養(yǎng)*胚胎培養(yǎng)已有近百年的歷史：1904年的Haning最早成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣椒的胚，并萌發(fā)形成小苗。30年代成功地把蘭科植物的胚培養(yǎng)成小植株。40年代在蘋果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、馬鈴薯、甘藍(lán)與大白菜的種間雜種的胚胎培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)及子房與胚珠培養(yǎng)均取得了不同程度的進(jìn)展2024/1/851〔一〕胚胎培養(yǎng)的意義克服遠(yuǎn)緣雜種的不育性；使胚發(fā)育不全的植物獲得后代；縮短育種年限；研究與胚發(fā)育有關(guān)的內(nèi)外因素。2024/1/852〔二〕離體胚培養(yǎng)離體胚培養(yǎng)包括胚胎發(fā)生過(guò)程中不同發(fā)育期的胚，一般可分為成熟胚和幼胚培養(yǎng)。2024/1/8531.成熟胚培養(yǎng)指子葉期后至發(fā)育完全的胚。培養(yǎng)較易成功，在含有大量無(wú)機(jī)元素和糖的根本培養(yǎng)基上，就能正常生長(zhǎng)成幼苗。將成熟或未成熟種子用70％酒精進(jìn)行幾秒鐘的外表消毒→無(wú)菌水沖洗3-4次→無(wú)菌條件下進(jìn)行解剖，取出胚并接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)。2024/1/854

培養(yǎng)基：WhiteTukeyMS無(wú)機(jī)鹽+糖(1-2%)+生長(zhǎng)輔助物質(zhì)(激素、AA、活性炭、維生素等)2024/1/855幼胚是指子葉期以前的幼小胚。由于幼胚培養(yǎng)在遠(yuǎn)緣雜交育種上有極大的利用價(jià)值，其研究應(yīng)用越來(lái)越深入廣泛。幼胚培養(yǎng)技術(shù)：心形期胚或更早期的胚〔長(zhǎng)度僅0.1～0.2mm〕胚越小就越難培養(yǎng),幼胚培養(yǎng)成功的有大麥、薺菜、甘蔗、甜菜、胡蘿卜等2024/1/8562.幼胚〔未成熟胚〕培養(yǎng)：〔1〕未成熟胚胎的培養(yǎng)有三種不同的發(fā)育方式：a.繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育，維持“胚性生長(zhǎng)〞；b.早熟萌發(fā)，即培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗；c.胚在培養(yǎng)基中發(fā)生細(xì)胞增殖形成愈傷組織，并由此再分化形成多個(gè)胚狀體或芽原基。2024/1/857〔2〕幼胚培養(yǎng)技術(shù)幼胚培養(yǎng)的操作方法與成熟胚培養(yǎng)方法根本相同。值得注意的是切取幼胚必須在高倍解剖鏡下進(jìn)行，操作時(shí)要細(xì)心，盡量取出完整的胚。幼胚培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，是提供幼胚所必需的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件。2024/1/858

①培養(yǎng)基幼胚對(duì)培養(yǎng)基要求較高，常用的培養(yǎng)基有Tukey，Nitch、MS，B5培養(yǎng)基；2024/1/859通常存在的影響條件如下：②生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)不同植物的胚培養(yǎng)需要的生長(zhǎng)物質(zhì)不同。如IAA可明顯促進(jìn)向日葵胚的生長(zhǎng)；IAA，Kt的共同作用可促進(jìn)薺菜幼胚的生長(zhǎng)；一般認(rèn)為IAA可使胚的長(zhǎng)度增加；參加BA可提高胚的生存時(shí)機(jī)；2024/1/860③天然提取物的作用椰乳對(duì)胚培養(yǎng)有一定的促進(jìn)作用〔番茄胚在含有50%椰乳的培養(yǎng)基中可維持生長(zhǎng)〕一些瓜類的胚乳提取物能促進(jìn)胚生長(zhǎng)的能力。2024/1/861④溫光條件對(duì)于大多數(shù)植物的胚來(lái)說(shuō)，在25-30℃為宜早熟果樹(shù)如桃的種胚，必須經(jīng)過(guò)一定的低溫春化階段才能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，而馬鈴薯胚以20℃為好。光照可以促進(jìn)某些植物胚的轉(zhuǎn)綠，利于胚芽生長(zhǎng)，而黑暗那么利于胚根生長(zhǎng)。因此以光暗交替培養(yǎng)較為有利。2024/1/862⑤其它條件胚培養(yǎng)中除要求較高的蔗糖〔4.5%〕濃度、高滲透壓以外，還要求較高濃度的氨基酸及無(wú)機(jī)鹽。2024/1/8632024/1/864(三)胚珠培養(yǎng)１.定義：胚珠培養(yǎng)是將授粉的子房在無(wú)菌條件下解剖后，取胚珠置于培養(yǎng)基培養(yǎng)的過(guò)程。有時(shí)也把胚珠連同胎座一起取下來(lái)培養(yǎng)。2024/1/865柱頭花柱子房花梗花托花組成2024/1/866胚囊卵細(xì)胞珠心珠孔反足細(xì)胞珠被胚珠極核

株柄2024/1/8672.意義：

胚珠培養(yǎng)可以解決象蘭科植物成熟胚較小不易培養(yǎng)的問(wèn)題。另一方面在未受精的胚珠培養(yǎng)中，可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體，用于單倍體育種。

3.培養(yǎng)技術(shù)：從花中取出子房→→70%酒精消毒30秒→→無(wú)菌水沖洗→→5%次氯酸鈉液中滅菌10分鐘→→無(wú)菌水沖洗數(shù)次→→在無(wú)菌條件下進(jìn)行解剖→→取出胚珠→→放在培養(yǎng)基上→→培養(yǎng)根本培養(yǎng)基：用Nistch培養(yǎng)基MS、N6、B5等培養(yǎng)基也可采用關(guān)鍵：選擇胚的發(fā)育時(shí)期——球形胚期的胚珠較易培養(yǎng)成功2024/1/8684.發(fā)育方式：2024/1/869未受精胚珠受精胚珠愈傷組織發(fā)育成種子大孢子或卵分化為單倍體植株再生植株(四)子房培養(yǎng)2024/1/8701.取材：開(kāi)花前1－5天摘下未授粉子房；或授粉后摘下子房。2.滅菌：

材料處理(禾谷類植物用70%酒精擦洗幼穗；雙子葉植物花蕾用飽和漂白粉滅菌15分)→→70%浸30秒→→無(wú)菌水沖洗→→0.1%升汞15－20分鐘→→無(wú)菌水沖洗→→無(wú)菌濾紙吸干。3.接種：無(wú)菌條件下剝開(kāi)幼花，夾出子房并接種于培養(yǎng)基〔MS、N6等〕。4.培養(yǎng)：溫度26℃,相對(duì)濕度50-60%，16h散射光。2024/1/871

胚乳是由兩個(gè)單倍的極核和一個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的三倍體組織。由它可獲得無(wú)子結(jié)實(shí)的三倍體植株，進(jìn)而可將它加倍成六倍體植株。2024/1/872(五)胚乳的培養(yǎng)培養(yǎng)方法：1.取材與接種取授粉4-8d后的幼果→常規(guī)消毒→在無(wú)菌條件下切開(kāi)果實(shí)→取出種子→別離出胚乳→接種2.培養(yǎng)基:MS、White+2，4-D〔NAA，〕+6-BA，2024/1/8733.培養(yǎng)在25-27℃，黑暗條件或散射光下培養(yǎng)約6-l0d胚乳開(kāi)始膨大→形成愈傷組織→分化培養(yǎng)基上〔附加6-BA，，少量的NAA〕培養(yǎng)→待愈傷組織長(zhǎng)出芽后，取下不定芽→生根培養(yǎng)基→光下培養(yǎng)10-15d，切口處可長(zhǎng)出白色的不定根。2024/1/8742024/1/876第4節(jié)植物組織與器官培養(yǎng)實(shí)例植物組織培養(yǎng)：將離體的植物組織〔器官、細(xì)胞、胚胎、原生質(zhì)體〕等在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。{誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛伏芽}植物器官培養(yǎng)：將誘導(dǎo)的或植株上原有的各種器官，放在無(wú)菌的人工環(huán)境中讓其進(jìn)一步發(fā)育，最終長(zhǎng)成幼苗或大量繁殖的過(guò)程。植物離體無(wú)性繁殖簡(jiǎn)稱離體繁殖〔invitropropagation)、微型繁殖〔micropropagation)，是指利用離體培養(yǎng)技術(shù)將來(lái)自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，并在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的植株的方法〔技術(shù)〕。用這種方法得到的植株群體稱單株無(wú)性系。(來(lái)自一個(gè)單株〔或一個(gè)單芽〕，它們遺傳組成相同)近400種植物離體繁殖已獲成功。蘭花、無(wú)子西瓜、馬鈴薯、楊樹(shù)等已在種苗生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。植物離體無(wú)性繁殖的意義〔優(yōu)越性〕繁殖速度快，經(jīng)濟(jì)效益高占用空間小，不受地區(qū)季節(jié)限制，便于工廠化育苗可以繁殖各種珍稀、涉危苗木離體繁殖周期：1～3個(gè)月繁殖系數(shù)：幾十～幾百倍又稱快繁離體繁殖是建立在體細(xì)胞系的根底上，是在人工控制的環(huán)境條件下，不會(huì)造成性狀別離，也不會(huì)退化，同時(shí)還可防止病蟲(chóng)害的侵染。利于篩選突變體，為育種效勞手指玫瑰由根組織培養(yǎng)的蒲公英幼苗植物離體無(wú)性繁殖的方式器官發(fā)生型(organogenesistype)胚狀體發(fā)生型(embryogenesistype)不定芽型〔adventitiousbudtype)器官型(organtype)原球莖型(protocormtype)球莖芽型塊莖型鱗莖型孢子型根莖型微枝扦插型器官發(fā)生型(organogenesistype)：誘導(dǎo)器官外植體產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)分化培養(yǎng)形成芽、根再生成植株的方式。技術(shù)關(guān)鍵：外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織要早期挑選，使其來(lái)源盡量一致。特點(diǎn)：繁殖速度快；培養(yǎng)經(jīng)愈傷組織階段再生成植株，遺傳性不穩(wěn)定，易產(chǎn)生變異。蘆薈、煙草、油菜等2024/1/882無(wú)菌母株制備增殖、分化植株再生及鑒定煉苗和移植器官發(fā)生型基本程序培養(yǎng)基中激素配比激素種類及濃度根本培養(yǎng)基組成滲透壓逐步過(guò)渡培養(yǎng)基篩選材料滅菌胚狀體發(fā)生型(embryogenesistype)：指植物器官、組織和細(xì)胞外植體經(jīng)培養(yǎng)脫分化形成胚狀體再成苗的方式。技術(shù)關(guān)鍵：提高不同外植體胚狀體發(fā)生及萌發(fā)率和提高胚狀體同步化率。特點(diǎn)：胚狀體發(fā)生數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整，繁殖系數(shù)高；遺傳性穩(wěn)定。甘蔗、胡蘿卜、石刁柏等不定芽型〔adventitiousbudtype)：選取具有頂芽和腋芽的短枝無(wú)菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽萌發(fā)成苗或增殖產(chǎn)生許多不定芽發(fā)育成苗，將新萌生的枝條再轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽到苗的增殖過(guò)程，最后使其生根形成植株的方式。技術(shù)關(guān)鍵：打破頂端優(yōu)勢(shì)，促使腋芽增殖并促其生根。特點(diǎn)：繁殖率高、保持物種的遺傳穩(wěn)定性，多用于林木的繁殖。FLash器官型(organtype)指直接從莖、葉、鱗片等外植體上誘導(dǎo)不定芽或帶芽的休眠器官〔如小鱗莖、小球莖、小塊莖〕產(chǎn)生再生成植株的方式。技術(shù)關(guān)鍵：對(duì)培養(yǎng)基要求高，控制好激素濃度，防止愈傷組織發(fā)生。優(yōu)點(diǎn)：繁殖率高，速度較快；遺傳性穩(wěn)定。三倍體無(wú)籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、絲石竹等原球莖型(protocormtype)蘭屬特有的方式，即外植體經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生原球莖，再直接長(zhǎng)成植株。球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型

葉柄外表產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植唐菖蒲觀葉海棠塊莖型葉片或葉柄上形成粒狀芋塊，進(jìn)一步分化出芽和根塊莖芽可為繁殖系母體，不斷切割繁殖移栽，成活率高。花葉芋

鱗莖型鱗片近軸面或邊緣直接形成帶根的小鱗莖在試管內(nèi)形成小鱗莖需較長(zhǎng)時(shí)間百合 郁金香孢子型

用成熟或未成熟的孢子進(jìn)行培養(yǎng)孢子繁殖最困難的是外表消毒，萌發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)地錢狼尾蕨根莖型

蕨類具有橫向的莖及直立的短根莖，為組織培養(yǎng)的最正確外植體根狀莖上產(chǎn)生蕨葉及根，繁殖速度較孢子型快腎蕨等微枝扦插型

帶芽的小插條在試管內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌扦插為木本植物進(jìn)行快速繁殖的主要方式葡萄、楊樹(shù)2024/1/893培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成大量元素(使用濃度大于0.5mmol/L)微量元素(使用濃度小于0.5mmol/L)2024/1/894無(wú)機(jī)鹽2024/1/895有機(jī)物氨基酸類重要的有機(jī)氮源維生素類以輔酶形式參與植物細(xì)胞代謝活動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)、分化具有很好的促進(jìn)作用vb1，vb6糖類主要的碳源—蔗糖？天然有機(jī)添加物類CM〔椰乳〕、馬鈴薯汁、酵母提取液〔YE〕、番茄汁等2024/1/896蔗糖濃度分別為0、1%、5%2024/1/897調(diào)節(jié)物質(zhì)〔一〕生長(zhǎng)素類促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和分裂、誘導(dǎo)愈傷組織形成、促進(jìn)生根，與一定量的細(xì)胞分裂素配合可誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)、胚狀體的產(chǎn)生等。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAAIAA為天然植物生長(zhǎng)素，見(jiàn)光易分解，高溫高壓易受破壞；2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于細(xì)胞啟動(dòng)脫分化階段；誘導(dǎo)分化那么用NAA、NBA或IAA。IBA誘導(dǎo)生根效果最好。2024/1/898〔二〕細(xì)胞分裂素類 促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化不定芽、解除頂端優(yōu)勢(shì)而促進(jìn)側(cè)芽增殖、抑制離體組織或器官衰老。 常用的有6-BA、KT、ZT6-BA2024/1/899BA分別為0,0.1,5mg/LNAA分別為0,0.1,5mg/L2024/1/8100〔三〕赤霉素類主要應(yīng)用GA3，促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)育成小植株，GA3不耐熱，水溶解后不穩(wěn)定，應(yīng)采用過(guò)濾除菌，并用酒精溶解。脫落酸抑制蛋白質(zhì)合成，抵消和抑制上述三種激素發(fā)揮作用；誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落。乙烯2024/1/8101植物細(xì)胞工程培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基母液的配制大量元素一般配成10倍濃度的母液；微量元素和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)常配成100倍濃度的母液；混合定容時(shí)，注意藥劑的添加順序及稀釋度，以免沉淀；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類物質(zhì)不溶于水,需用不同溶劑進(jìn)行溶解單獨(dú)配制的試劑：鐵鹽與EDTACaCl2

前P282024/1/8102以KNO3為例1L培養(yǎng)基需要量為19g。在配制母液時(shí)，增加10倍量，為190g。在母液中的濃度為190g/L，即0.19g/ml在配制培養(yǎng)基時(shí)，取10ml，10ml×0.19g/ml=19g回P262024/1/8103植物細(xì)胞工程培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制過(guò)程藥品按順序混合pH調(diào)整加熱溶解器皿水洗枯燥分裝培養(yǎng)基加塞

冷卻高壓蒸汽滅菌

2024/1/8104常用培養(yǎng)基到目前研制開(kāi)發(fā)了數(shù)十種適宜不同植物、不同組織、不同細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)基配方。但多數(shù)培養(yǎng)基配方是在幾種普遍應(yīng)用的培養(yǎng)基上演變而來(lái)的。這幾種常見(jiàn)的培養(yǎng)基為是：MS、ER、B5、N6、NT、White等，其配方如下：2024/1/81052024/1/8106培養(yǎng)基分類根據(jù)培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽含量的差異將其分為以下4類：①高無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基〔植物器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)〕；-MS②較高硝酸鹽含量培養(yǎng)基〔木本、十字花科和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)〕；-B5③中等無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基〔花藥培養(yǎng)〕；-H④低無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基〔生根〕。-WHITE2024/1/8107植物組織培養(yǎng)問(wèn)題分析試管苗玻璃化現(xiàn)象〔vitrification〕是指組織培養(yǎng)過(guò)程中的特有的一種生理失調(diào)或生理病變，試管苗呈半透明狀外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。玻璃化苗絕大多數(shù)為來(lái)自莖尖或莖段培養(yǎng)物的不定芽。通常玻璃化苗恢復(fù)正常的比例很低，在繼代培養(yǎng)中仍然形成玻璃化苗。2024/1/8108玻璃化的解決方法增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢(shì)；減少培養(yǎng)基中NH4+濃度；增加光照；增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行CO2施肥，這對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮參加適量脫落酸。2024/1/8109褐變問(wèn)題成因酶促----酚氧化成醌及聚合非酶促----醌聚合時(shí)段初代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)2024/1/8110①選擇適宜的外植體一般來(lái)說(shuō)，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。②適宜的培養(yǎng)條件無(wú)機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。③使用抗氧化劑在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地防止或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。④材料預(yù)處理和細(xì)胞篩選⑤使用吸附劑0.1%-0.5%的活性炭、PVP對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。⑥連續(xù)轉(zhuǎn)移對(duì)容易褐變的材料可間隔12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過(guò)連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法2024/1/8111微生物污染問(wèn)題原因消毒不徹底外植體消毒問(wèn)題培養(yǎng)基及器皿消毒問(wèn)題環(huán)境消毒問(wèn)題無(wú)菌操作不過(guò)關(guān)2024/1/8112外植體消毒問(wèn)題外植體取材外植體(expant)是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織。來(lái)源：2024/1/8113外植體消毒問(wèn)題外植體滅菌的過(guò)程：

流水沖洗10~20min

外表消毒

無(wú)菌水沖洗4~5次

瀝水待用Flash2024/1/8114常用消毒劑消毒滅菌效果比較消毒劑使用濃度%去除的難易消毒時(shí)間min效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過(guò)氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9~102飽和溶液1~210~120.1~170~754~5(mg/L)1易易易易最易較難易中較難5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好較好好2024/1/8115容器容積（mL）121℃下所需的最少滅菌時(shí)間(min）20~5075250~500100015002000152025303540培養(yǎng)基及器皿消毒滅菌問(wèn)題培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所需的最少時(shí)間2024/1/8116培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基組成中假設(shè)含有遇熱易分解物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、維生素、尿素、酶等，那么必須用過(guò)濾法除菌。過(guò)濾除菌時(shí)，使用孔徑為0.22~0.45μm或更小的細(xì)菌濾膜。過(guò)濾除菌可利用抽濾裝置或注射過(guò)濾器進(jìn)行，所用器皿均應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓消毒滅菌，滅菌溫度不超過(guò)121℃。2024/1/8117器皿消毒滅菌手術(shù)刀鑷子平皿干熱滅菌150-160℃，2h2024/1/8118環(huán)境消毒問(wèn)題2024/1/8119無(wú)菌操作問(wèn)題

評(píng)價(jià)以下操作正確與否2024/1/8120評(píng)價(jià)以下操作正確與否2024/1/8121評(píng)價(jià)以下操作正確與否2024/1/8122評(píng)價(jià)以下操作正確與否2024/1/8123無(wú)菌操作無(wú)菌操作前的準(zhǔn)備工作無(wú)菌操作臺(tái)的使用操作所用器械應(yīng)浸泡在95%酒精中，用前需放在耐熱器皿中參加少量酒精后進(jìn)行灼燒，每次使用后都要滅菌。無(wú)菌操作步驟外植體的適當(dāng)切割的本卷須知繼代培養(yǎng)的材料(液體材料、固體材料〕2024/1/81243.1.4.4其他問(wèn)題培養(yǎng)條件控制激素水平光照：時(shí)間，強(qiáng)度和光質(zhì)。溫度：適溫有利于細(xì)胞分裂與分化，而在一定范圍內(nèi)降低培養(yǎng)溫度可以使細(xì)胞的質(zhì)量增加；培養(yǎng)基晝夜變溫可能有利于器官的發(fā)生。pH通常使用的pH值的范圍是5.5－6.5。pH<4或>7，培養(yǎng)物不能正常生長(zhǎng)。氣體2024/1/8125激素水平的控制生長(zhǎng)素應(yīng)用的濃度范圍為0.1~15mg/L。在細(xì)胞脫分化過(guò)程中，啟動(dòng)細(xì)胞分裂形成愈傷組織，以2,4-D最為有效。細(xì)胞脫分化需要高濃度的2,4-D，當(dāng)胚性細(xì)胞形成轉(zhuǎn)入再分化時(shí)，那么需較低的2,4-D濃度。使用濃度范圍為0.1~10mg/L。細(xì)胞分裂素既可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，又可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。2024/1/812616h/d24h/d0h/d光照時(shí)間的影響2024/1/8127液體振蕩培養(yǎng)的愈傷組織生長(zhǎng)與振蕩頻率的關(guān)系2024/1/81283.2植物胚胎培養(yǎng)Flash2024/1/8129概念花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)范疇也稱小孢子培養(yǎng)花藥及花粉培養(yǎng)把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上，使其發(fā)育和分化成植株的過(guò)程從花藥中別離出花粉粒使之成為分散或游離的狀態(tài)，通過(guò)培養(yǎng)使其脫分化并發(fā)育成植株的過(guò)程2024/1/8130獲得單倍體植株花藥培養(yǎng)的根本程序：Flash選處于生殖生長(zhǎng)頂峰期的花藥，需