重亞硫酸鹽修飾基因組DNA的制備采用EZDNAMehtylation-GoldKitTMD5005試劑盒，按照操作說明書分別對提取的Blank、Cya基因組DNA進行重亞硫酸鹽修飾。分別吸取10uLBlank和CyaDNA樣品到PCR管中，加入10uL水補足20uL，每個樣品加130uLCTconversionreagent。輕彈管子或者用槍吹打混勻，離心使液體沉到管底。將管子放到熱循環儀中，運行以下步驟：98°ClOmin64C2.5h4C保存可至20h力口600uLM-BindingBuffer到Zymo-SpinTMICColumn,柱子放在提供的收集管中。把樣品（來自步驟2）加到裝M-BindingBuffer的Zymo-SpinTMICColumn中。蓋上蓋子，顛倒混勻。全速離心（210000g）30s。倒掉流穿液。力口100uLM-WashBuffer到柱子上。全速離心30s。力口200uLM-DesulphonationBuffer到柱子上，室溫（20C-3OC）靜置15-20min。孵育完成后，全速離心30s。力口200uLM-WashBuffer到柱子上。全速離心30s。另加200uLM-WashBuffer，再離心30s。把柱子放到1.5mL離心管。垂直加10uLM-Elutionbuffer到柱子基質。全速離心30s洗脫DNA。二．PCR擴增反應模板：重亞硫酸鹽修飾的Blank、Cya基因組DNA引物上游：CTCAAGCTTCGAATTTTTTTATAAGAAGAAGATAAG下游：TAGATCCGGTGGATCAAAACTCCACCACAAACCACTT目的片段長度：476bp1.操作步驟：反應體系模板 0.5uL10XKODplusbuffer 5uLdNTPSMixture(2.5mMeach)5uLMg2+4uL上游引物3uL下游引物3uLDMSO4uLKODplus酶2uLddH2O23.5uLTotal50uL

反應條件：95°C3min95C25s；48C15s；72C45s。35Cycles72C10min；4C8。電泳將上述50uLPCR產物與10uL6XLoadingBuffer混勻，經1%瓊脂糖凝膠電泳：125V,25min；凝膠圖像分析系統觀察結果，拍照。MBlankCya結果：MBlankCya20001000750500250100目的片段切膠回收按照AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段。在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，計算凝膠重量，該重量作為一個凝膠體積。加入3個凝膠體積的BufferDE-A，混合均勻后于75C加熱，間斷混合，直至凝膠塊完全熔化。加0.5個BufferDE-A體積的BufferDE-B，混合均勻。吸取步驟3中的混合液，轉移到DNA制備管中，12000Xg離心1min。棄濾液。將制備管置回2mL離心管，加500uLBufferW1,12000Xg離心30s，棄濾液。將制備管置回2mL離心管，加700uLBufferW2,12000Xg離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用700uLBufferW2洗滌一次，12000Xg離心1min。將制備管置回2mL離心管中，12000Xg離心2min。將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在制備膜中央加25uL加熱至65C的去離子水，室溫靜置1min。12000Xg離心1min洗脫DNA。三．重組YFPC1質粒EcoRI、BamHI雙酶切將抽提好的YFPC1質粒按以下步驟進行雙酶切。反應體系：EcoRI1uLBamHI1uLYFPC1質粒5uL10XK2uLH2O11uL共4管反應條件：37°C2h酶切完成后，4管合成2管，1%瓊脂糖凝膠檢測，結果正確。切膠回收。連接采用GenaCopoeiaFast-Fusion?克隆試劑盒。反應體系：YFPC1雙酶切產物5uL目的片段 3UL10XClonaseBuffer1uLFast-FusionTMClonase1uL輕彈管壁使配置好的反應液分散均勻。25C溫育15min。冰上保存直至轉化。四．轉化從-80C冰箱取出大腸桿菌DH5a感受態細胞懸液，室溫解凍，解凍后立即置于冰上。將重組產物全部加入感受態中，輕彈混勻，冰上放置30min。42C水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5min。向管中加入800uL無抗LB液體培養基，混勻后搖床37C，200rpm培養1h。菌液5000rpm離心5mi