整合訓練(十七)基因工程和生物技術(shù)的安全性與倫理問題全員必做題1.[2023·廣東湛江統(tǒng)考二模]紅細胞生成素(EPO)是人體內(nèi)促進紅細胞生成的一種糖蛋白，可用于治療腎衰性貧血等疾病。由于天然EPO來源極為有限，某科研團隊采用基因工程培育轉(zhuǎn)基因羊作為乳腺生物反應器，使其能合成EPO。下列有關(guān)敘述錯誤的是()A．構(gòu)建表達載體時需將EPO基因插入乳腺蛋白基因的啟動子的上游B．一般情況下，該轉(zhuǎn)基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺細胞中表達C．可用顯微注射技術(shù)將含有EPO基因的表達載體導入羊的受精卵中D．用PCR擴增人EPO基因，需要一段已知的EPO基因核苷酸序列2．[2023·山東聊城統(tǒng)考三模]Cre-loxP系統(tǒng)能實現(xiàn)特定基因的敲除(如圖1)。把幾種熒光蛋白基因和Cre酶能識別并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起，構(gòu)建表達載體T(如圖2)。部分熒光蛋白基因會被Cre酶隨機“剪掉”，且兩個loxP1之間或兩個loxP2之間的基因，最多會被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表達，隨機呈現(xiàn)不同的顏色。下列說法錯誤的是()A．構(gòu)建表達載體T時用到的工具酶包括限制酶、DNA連接酶B．若小鼠細胞含一個表達載體T(不含Cre酶)，其肌肉組織細胞呈無色C.若小鼠細胞含一個表達載體T(含Cre酶)，其腦組織細胞只能呈紅色或黃色D．若小鼠細胞含兩個表達載體T(含Cre酶)，其腦組織細胞可能出現(xiàn)兩種顏色3．[2023·山東青島統(tǒng)考一模]新型冠狀病毒(2019-nCoV)的檢測可以采用實時熒光RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應)的方法，RT-PCR的具體過程如圖，下列敘述正確的是()A．PCR體系中一定要添加從受體細胞中提取的DNA聚合酶B．過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，理論上需要2n個引物BC．該技術(shù)用于對某些微量RNA病毒的檢測，可提高檢測的靈敏度D．PCR反應中周期性的溫度設(shè)置是特定的，與擴增的目的基因和引物無關(guān)4．[2023·山東青島統(tǒng)考一模](不定項)大腸桿菌經(jīng)溶菌酶和洗滌劑處理后，擬核DNA就會纏繞在細胞壁碎片上，靜置一段時間，質(zhì)粒分布在上清液中，利用上述原理可初步獲得質(zhì)粒DNA。用三種限制酶處理提取的產(chǎn)物，電泳結(jié)果如圖所示。下列關(guān)于質(zhì)粒的粗提取和鑒定的敘述正確的是()A．提取DNA時可加入酒精，使溶于酒精的蛋白質(zhì)等物質(zhì)溶解B．將提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，可用二苯胺試劑進行鑒定C．電泳鑒定DNA利用了DNA在電場中會向著與它所帶電荷相反的電極移動的原理D．根據(jù)電泳結(jié)果，質(zhì)粒上一定沒有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位點，而有限制酶Ⅲ的切割位點5．[2023·遼寧校聯(lián)考三模](不定項)Fst基因可以表達卵泡抑素，降低皮脂率，提高瘦肉率。研究人員為得到轉(zhuǎn)Fst基因瘦肉型豬，從鴨的卵泡中提取RNA，通過RT—PCR擴增獲得Fst基因，將其與運載體PBR322結(jié)合，通過精子介導法將重組目的基因?qū)胧荏w細胞并成功獲得轉(zhuǎn)基因瘦肉型豬(如圖所示，AmpR為氨芐青霉素抗性基因)。下列敘述正確的是()A．②過程需要兩種引物，且引物中C、G堿基的含量基本相同B．③過程利用pvul和sspl雙酶切有利于目的基因與運載體準確連接C．精子介導法是利用精子將重組目的基因直接導入受精卵的過程D．欲篩選導入PBR322—Fst的大腸桿菌可在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素6．[2023·山東濟南統(tǒng)考一模]研究發(fā)現(xiàn)，大部分白血病患者細胞中存在異常的融合基因UBA2—WTIP，可作為檢測白血病的特異性分子標志物?？蒲腥藛T通過RT—PCR方法克隆得到融合基因UBA2—WTIP，為了研究該基因的作用和致病機制，需要構(gòu)建重組載體并把目的基因和FLAG標簽基因序列連接起來，分別獲得帶有FLAG肽鏈的UBA2—WTIP融合蛋白和WTIP蛋白。FLAG肽鏈由8個氨基酸殘基組成，可作為基因工程中蛋白質(zhì)是否表達的標記。(1)科研人員以提取的某白血病人外周血細胞總RNA為模板，經(jīng)過____________過程合成cDNA，設(shè)計________種引物，經(jīng)RT—PCR擴增出融合基因UBA2—WTIP。對測序結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，推測融合基因UBA2—WTIP是在UBA2基因的第16外顯子與WTIP基因的第2外顯子處拼接而成，如圖1所示。為了驗證該融合基因的產(chǎn)生是基因組DNA融合而不是不同的RNA剪接后逆轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的，可通過PCR驗證，其實驗思路和預期結(jié)果為________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)為了構(gòu)建重組載體，科研人員設(shè)計了以下2種引物，如圖2所示：上游引物F2為：5′TATGGTACCATG①GCACTGTCGCGGGGG3′，GGTACC為KpnⅠ酶切位點；下游引物R2為：5′TAT②TCA③GAGCTCAGTGACGTG3′；FLAG標簽基因編碼鏈序列eq\a\vs4\al(（5′GATTACAAGGATGACGACGATAAG3′）)可以插入目的基因編碼區(qū)的首端或者末端。已知引物中ATG對應起始密碼，若UBA2—WTIP融合基因編碼的蛋白質(zhì)前端有一段信號肽，則FLAG標簽基因序列一般不能插入①位置，原因是____________________________________________________________；若在下游引物R2②③處插入FLAG標簽基因序列和EcoRⅠ酶切位點，已知引物中TCA對應終止密碼，位置③處序列為5′__________________3′。(3)制備的重組載體體外轉(zhuǎn)染人類白血病細胞株KG—la細胞，提取各細胞總蛋白，用FLAG單克隆抗體檢測蛋白表達情況，并分別測定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對照細胞、轉(zhuǎn)錄UBA2—WTIP融合基因及轉(zhuǎn)錄WTIP基因的KG－la細胞增殖情況，結(jié)果分別如圖3所示。檢測相關(guān)蛋白質(zhì)是否表達的方法是______________________________；上述生長曲線結(jié)果說明________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。重點選做題7.[2023·山東青島統(tǒng)考一模]原位PCR技術(shù)是利用原位PCR儀，在組織或細胞中靶DNA所在的位置上進行的PCR循環(huán)擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結(jié)合原位雜交進行檢測的方法。進行擴增時，反應體系中的反應成分需滲透到組織或細胞的靶DNA處才能進行擴增。PCR反應體系中需要添加一定濃度的Mg2＋，而組織細胞間的物質(zhì)會吸附Mg2＋，使進入細胞的Mg2＋減少。下列說法正確的是()A．原位PCR技術(shù)可用于人類β—地中海貧血致病基因的檢測B．原位PCR反應體系中使用的Mg2＋濃度要比常規(guī)PCR低C．反應體系中引物的G、C堿基含量越高，其結(jié)合的特異性越強D．反應體系中NTP作為擴增的原料，會依次連接到子鏈的5′端8．[2023·廣東統(tǒng)考二模]T-2毒素是一種常見的霉菌毒素，可通過污染飼料引起畜禽中毒。CYP3A是豬體內(nèi)降解T-2毒素的關(guān)鍵酶，T-2毒素可誘導其表達水平升高。CCAATbox和GCbox是CYP3A基因啟動子的兩個調(diào)控序列。研究者將不同調(diào)控序列分別和CYP3A基因啟動子及LUC基因(熒光素酶基因)連接構(gòu)建表達載體，導入豬肝細胞，在培養(yǎng)基中加入T-2毒素，24h后計算啟動子活性相對值，結(jié)果如圖所示。下列敘述正確的是()A．④為對照組，把僅含LUC基因的表達載體導入細胞B．與④組相比，①組中加入T-2毒素的含量大大增加C．可通過檢測熒光素酶的活性來計算啟動子活性相對值D．調(diào)控序列的缺失使T-2毒素不能誘導CYP3A基因表達9．[2023·遼寧校聯(lián)考三模]血凝素基因(HA)編碼的血凝素是構(gòu)成流感病毒包膜纖突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2兩個亞單位，其中HA1含有病毒與受體相互作用的位點。人IgG抗體中的一段小肽，常作為融合蛋白標簽，由IgGFc基因的片段(長度為717bp)編碼。蛋白質(zhì)分泌依賴于信號肽的引導，本研究中用信號肽IL－2SS代替HA自身信號肽，科研人員嘗試構(gòu)建IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表達載體，并導入大腸桿菌表達和分泌。請回答下列問題：(1)流感病毒包膜主要由__________組成，包膜上血凝素的合成場所在________________。(2)本實驗用信號肽IL-2SS代替HA自身信號肽有利于融合蛋白分泌到大腸桿菌細胞外，PCR擴增目的基因時應該選擇圖中引物________。設(shè)計引物時，不能包含基因HA1的終止密碼子的編碼序列，原因是__________________________________。(3)應選擇限制酶________來切割質(zhì)粒A，然后直接將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒A混合，同時加入________DNA連接酶，使得目的基因與質(zhì)粒A相連。若目的基因與質(zhì)粒A正向連接，用BamHⅠ和SacⅠ同時切割重組質(zhì)粒，完全酶切后的產(chǎn)物中短片段的長度約為________bp。(4)有時為了滿足應用需要，會在載體中人工構(gòu)建誘導型啟動子，當誘導物存在時，可以______________________________。(5)圖示中的限制酶有的來自于大腸桿菌，但限制酶不能切割大腸桿菌本身的DNA分子，原因是__________________________。10．[2023·河南校聯(lián)考三模]研究者將某基因改造并插入質(zhì)粒中，然后導入大腸桿菌中獲得表達產(chǎn)物。將獲得的突變基因?qū)肫胀ù竽c桿菌之前，先構(gòu)建基因表達載體。下圖1為所用載體示意圖，表為限制酶的識別序列及切割位點。下圖2為通過PCR定點誘變改造基因的流程圖。請回答下列問題：(1)構(gòu)建基因表達載體時，為使目的基因與載體正確連接，在擴增目的基因時，應在其一對引物的5′端分別引入____________兩種不同限制酶的識別序列。在目的基因和載體連接時，可選用____________(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。(2)構(gòu)建的基因表達載體中需要使用大腸桿菌蛋白基因的啟動子tac，原因是____________________________。將受體菌置于含有____________的培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)，以獲得能表達基因產(chǎn)物的細菌。(3)利用大引物PCR進行定點誘變需要進行兩輪PCR，PCR過程中需要____________________酶。在第一次PCR中，至少需要________個循環(huán)才能獲得相應的大引物模板。利用所獲得的大引物模板和其他引物進行第二次PCR過程，要獲得帶有誘變點的改良基因，引物應選用大引物兩條鏈中的________(填“①”或“②”)。與X射線誘變相比，該突變技術(shù)的優(yōu)點是__________________。整合訓練（十七）1．解析：啟動子是一段特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，故構(gòu)建表達載體時需將EPO基因（目的基因）插入乳腺蛋白基因的啟動子的下游，A錯誤；結(jié)合題干“某科研團隊采用基因工程培育轉(zhuǎn)基因羊作為乳腺生物反應器，使其能合成EPO”可知該轉(zhuǎn)基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺細胞中表達，到合適時期收集羊的乳汁進行相關(guān)產(chǎn)物的檢測與鑒定，B正確；將目的基因?qū)雱游锸芫炎畛Ｓ玫姆椒ㄊ抢蔑@微注射將目的基因注入動物的受精卵（全能性高）中，整個受精卵發(fā)育成為具有新性狀的動物，C正確；用PCR擴增人EPO基因，前提是需要一段已知的EPO基因核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物，D正確。答案：A2．解析：基因表達載體構(gòu)建過程中需要限制酶和DNA連接酶兩種工具酶處理，A正確；據(jù)圖可知，小鼠有編碼紅、黃、藍熒光蛋白的基因，前端有腦組織特異性表達的啟動子，肌肉細胞不會表達顏色基因，故若小鼠細胞含一個表達載體T（不含Cre酶），其肌肉組織細胞呈無色，B正確；1oxP1、1oxP2位置如圖2黑白三角符號所示，兩個loxP1和兩個loxP2之間的基因最多會被Cre酶敲除一次，將含Cre酶的病毒注入小鼠體內(nèi)，Cre酶表達情況不同，識別的loxP不同，則有可能未敲除熒光蛋白基因，此時為紅色（同不含Cre酶時），也有可能敲除兩個loxP1之間的紅色熒光蛋白基因，此時為黃色，也有可能敲除兩個1oxP2之間的紅色和黃色熒光蛋白基因，此時為藍色，因而不同腦細胞會差異表達紅色、黃色或藍色熒光蛋白基因，C錯誤；小鼠腦組織細胞內(nèi)有2個相同表達載體T（含Cre酶），Cre酶對每個DNA片段隨機剪切，因而細胞的顏色由細胞內(nèi)兩種熒光蛋白的顏色疊加而成，故其腦組織細胞可能出現(xiàn)兩種顏色，D正確。答案：C3．解析：PCR體系中需要的是耐高溫的DNA聚合酶，不是從受體細胞中提取的DNA聚合酶，A錯誤；過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，根據(jù)DNA分子半保留復制特點可知，該過程理論上至少需要2n－1個引物B，B錯誤；利用實時熒光RT-PCR技術(shù)對某些微量RNA病毒進行檢測時可提高檢測的靈敏度，是因為增加了待測RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA的數(shù)量（或濃度），便于檢測，C正確；PCR反應中溫度呈現(xiàn)周期性變化，其中加熱到90～95℃的目的是使雙鏈DNA解聚為單鏈，然后冷卻到55～60℃使引物與互補DNA鏈結(jié)合，繼續(xù)加熱到70～75℃，目的是在DNA聚合酶作用下進行延伸。所以PCR反應中周期性的溫度可在一定范圍內(nèi)設(shè)置，不是特定的，D錯誤。答案：C4．解析：DNA在冷酒精中溶解度很低，提取DNA時可加入酒精，是為了讓DNA析出，蛋白質(zhì)等物質(zhì)溶解，A正確；將提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，可用二苯胺試劑在沸水浴條件下進行鑒定，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色，B正確；DNA帶負電，電泳鑒定DNA利用了DNA在電場中會向著與它所帶電荷相反的電極移動的原理，C正確；因為質(zhì)粒的本質(zhì)是環(huán)狀的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ處理后電泳只有一條條帶，可能是該質(zhì)粒上有一個切割位點，也可能沒有切割位點，D錯誤。答案：ABC5．解析：②過程需要兩種引物，引物中C、G堿基的含量一般不相同，A錯誤；為了使目的基因與質(zhì)粒正確連接，③過程利用pvul和sspl雙酶切目的基因與運載體，B正確；精子介導法是利用精子將重組目的基因直接導入卵細胞的過程，C錯誤；重組質(zhì)粒中含有氨芐青霉素抗性基因，所以篩選導入PBR322—Fst的大腸桿菌可在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素，D正確。答案：BD6．解析：（1）科研人員以提取的某白血病人外周血細胞總RNA為模板，經(jīng)過逆（反）轉(zhuǎn)錄過程合成cDNA。DNA分子是雙鏈，PCR時以每一條為模板，合成子代DNA，因此需要兩種引物。據(jù)圖可知，如果融合基因UBA2—WTIP是在UBA2基因的第16外顯子與WTIP基因的第2外顯子處拼接而成，那么該基因長度為239bp，能以F1和R1引物進行PCR擴增，因此如果提取該病人的DNA，使用圖中F1和R1引物進行PCR擴增，若出現(xiàn)239bp擴增片段，該融合基因的融合方式是基因組水平融合。（2）PCR時，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3′端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5′端向3′端延伸的，①位置前面為ATG，是翻譯的起始位置，若FLAG標簽基因序列插入①位置，UBA2—WTIP融合基因編碼的蛋白質(zhì)前端有一段信號肽，蛋白質(zhì)前端的信號肽一般會在蛋白質(zhì)成熟時被切割掉，不能得到帶有FLAG肽鏈的蛋白質(zhì)，因此一般不能插入①位置。標簽基因序列本身含有啟動子和終止子序列，不需要插在目的基因中的啟動子和終止子之間，因此若在下游引物R2②③處插入FLAG標簽基因序列和EcoRⅠ酶切位點，引物中TCA對應終止密碼，則③位置為FLAG標簽基因序列，F(xiàn)LAG標簽基因編碼鏈序列（5′GATTACAAGGATGACGACGATAAG3′），③處序列與此互補，為5′CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC3′。（3）檢測相關(guān)蛋白質(zhì)是否表達的方法是抗原—抗體雜交。據(jù)圖2結(jié)果可知，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對照細胞相比，轉(zhuǎn)錄WTIP基因的KG－la細胞增殖較少，轉(zhuǎn)錄UBA2—WTIP融合基因的KG－la細胞增殖較多，據(jù)此可知，UBA2—WTIP融合基因能在體外促進白血病細胞增殖，WTIP基因能抑制白血病細胞的增殖。答案：（1）逆（反）轉(zhuǎn)錄兩提取該病人的DNA，使用圖中F1和R1引物進行PCR擴增，若出現(xiàn)239bp擴增片段，該融合基因的融合方式是基因組水平融合（2）蛋白質(zhì)前端的信號肽一般會在蛋白質(zhì)成熟時被切割掉，所以不能得到帶有FLAG肽鏈的蛋白質(zhì)CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC（3）抗原—抗體雜交UBA2—WTIP融合基因能在體外促進白血病細胞增殖，WTIP基因能抑制白血病細胞的增殖7．解析：分析題干可知，原位PCR技術(shù)是通過摻入標記基團直接顯色或結(jié)合原位雜交進行檢測的方法，故推測原位PCR技術(shù)可用于人類β－地中海貧血致病基因的檢測，A正確；因為組織細胞間的物質(zhì)會吸附Mg2＋，故原位PCR反應體系中使用的Mg2＋濃度要比常規(guī)PCR高，B錯誤；在一定范圍內(nèi)，反應體系中引物的G、C堿基含量越高，其結(jié)合的特異性越強，但G、C過高，不利于退火，從而阻礙目標DNA的擴增，C錯誤；dNTP作為擴增的原料會依次連接到子鏈的3′端，D錯誤。答案：A8．解析：④為對照組，把含CYP3A基因啟動子及LUC基因的表達載體導入細胞，A錯誤；T-2毒素是無關(guān)變量，每組加入的含量要相同，因此與④組相比，①組中加入T-2毒素的含量相同，B錯誤；實驗的因變量是熒光素酶的活性，可通過檢測熒光素酶的活性來計算啟動子活性相對值，熒光素酶的活性越大，啟動子活性相對值就越大，C正確；由圖可知，②③④這三組的啟動子活性相對值都大于0，說明調(diào)控序列的缺失使T-2毒素可以誘導CYP3A基因表達，D錯誤。答案：C9．解析：（1）流感病毒包膜來源于宿主細胞的細胞膜，主要由蛋白質(zhì)和磷脂組成，病毒沒有細胞結(jié)構(gòu)，包膜上血凝素的合成場所在宿主細胞的核糖體。（2）由圖可知，引物b、c可與HA1兩端的堿基序列結(jié)合，故PCR擴增目的基因時應選擇圖中引物b和c。若設(shè)計引物時含有HA1的終止密碼子的編碼序列，則IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表達載體轉(zhuǎn)錄后形成mRNA，核糖體讀到終止密碼子時就停止翻譯，導致HA1基因之后的IgGFc基因的mRNA序列不能正常翻譯，產(chǎn)生的HA1上不含IgGFc標簽，因此設(shè)計引物時，不能包含基因HA1的終止密碼子的編碼序列。（3）由圖可知，限制酶EcoRⅤ切割可產(chǎn)生平末端，其識別切割位點恰巧處于IL-2SS和IgGFc中間，可選擇該酶對質(zhì)粒進行切割，然后直接將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒A混合，同時加入T4DNA連接酶（將DNA片段連接起來），使得目的基因與質(zhì)粒A相連。由圖可知HA1基因片段長度為1038－51＝987bp，重組質(zhì)粒長度為5554＋1038－51＝6541bp，IgGFc基因片段長度為717bp，二者正向相連時BamHⅠ作用于HA1中，SacⅠ酶作用于IgGFc末端，完全酶切后的產(chǎn)物的長度約為717＋1038－694＝1061bp、5554＋1038－51－1061＝5480bp。（4）載體中人工構(gòu)建誘導型啟動子可激活或者抑制目的基因的表達