第三節工業微生物菌種的別離和選育獲得菌種的途徑：〔1〕向菌種保藏機構索取有關菌株。國內：工業微生物菌種保藏管理中心〔CICC〕；農業微生物菌種保藏管理中心〔ACCC〕；中國微生物菌種保藏管理委員會〔CCCCM〕。國外：美國典型菌種保藏保藏中心〔ATCC〕；日本大阪發酵研究所〔IFO〕等?！?〕從自然界中篩選?！?〕從一些發酵制品中別離目的菌株。工業化生產對微生物菌種的要求：〔1〕能在廉價原料制成的培養基上迅速生長，并生成所需代謝產物，產量高?！?〕可在易于控制的培養條件下迅速生長和發酵?！?〕生長速度和合成速度較快，發酵周期短。〔4〕選育抗噬菌體能力強的菌株，使其不易感染噬菌體?！?〕菌種不易變異退化，以保證發酵生產和產品質量的穩定性?！?〕菌種不是病原菌，不產生任何有害的生物活性物質和毒素，以保證平安?！?〕菌種應在短期內〔最好3天或更短〕生產出目的產物。一微生物菌種的別離從自然界別離新菌種的一般步驟:采樣富集培養純種別離性能測定1采樣〔1〕主要依據所篩選的微生物生態及分布概況，綜合分析決定采樣地點。一般可從土壤中別離菌種。土壤中細菌最多，其次是放線菌和霉菌。一般較枯燥、偏堿性、有機質豐富的土壤中放線菌數量較多；酵母菌在土壤中數量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數量較多。1〕加蜜餞、糖果、蜂蜜環境的土壤中----耐高滲透壓的酵母菌、檸檬酸產生菌、氨基酸產生菌等2〕食品加工廠、飯店等的污水中常含有淀粉----淀粉酶產生菌3〕熱帶森林的腐葉爛草下的土壤----產纖維素酶的微生物4〕從油田的浸油土壤中----有利用石蠟、芳香烴、烷烴的微生物5〕從白腐態樹木中----可別離出分解木質素的微生物〔2〕土壤中采樣的本卷須知1〕由于土壤表層缺少水分，而且它以常受日光照射、風吹和行人踩踏，不利于微生物的生長，所以采樣一般采集離地表5~15cm的土壤為樣品。2〕由于土壤水分過多，那么可能造成土壤缺氧而使微生物生長不良，同時不僅能使土壤缺氧，而且由于流水，往往改變土壤中微生物的分布，因此防止雨季采樣。3〕通風情況：在通風較好的土壤中，細菌、放線菌繁殖較快，而通風差的土壤中，酵母、霉菌較多。4〕細菌或放線菌在堿性土壤中較多，它們在偏酸性土壤中受到抑制，而酵母菌那么喜歡偏酸性的環境。2富集培養根據所選菌種的生理特性，參加某些特定物質，使所需的微生物繁殖，造成數量上的優勢，限制不需要的微生物生長繁殖。如：篩選纖維素酶生產菌：以纖維素作為唯一碳源篩選脂肪酶：以植物油作為唯一碳源篩選酵母菌：控制適宜的培養基和pH值，可降低細菌的增殖率，霉菌生長慢篩選放線菌：在土壤樣品的懸浮液中加10%的酚數滴篩選霉菌：一般在培養基臨用前添加滅過菌的乳酸或鏈霉素富集培養的方法1〕控制營養成分營養成分是C、N、無機鹽及維生素等，各種微生物對各種營養成分的要求是有差異的，因此，控制富集培養基中的營養成分，對濃縮所需菌種是有益的。2〕控制培養基的酸堿度各種微生物生長繁殖的適宜酸堿度是不同的，細菌和放線菌一般要求中性和偏堿性，酵母和霉菌一般要求偏酸性。故可將培養基調節到一定的pH值有利于抑制不需要微生物的繁殖。3〕控制培養溫度和熱處理不同種類微生物所適宜的生長溫度不同，利用不同培養溫度可使不同的嗜溫性微生物生長速度不同。4〕添加抑制劑添加專一性抑制也可到達抑制不需增殖的微生物的目的。3純種別離常用的別離方法有劃線法和稀釋法。劃線法——將含菌樣品在固體培養基外表作有規那么的劃線，菌樣經過屢次從點到線的稀釋，最后經培養得到單菌落。稀釋法——不斷稀釋使被別離的樣品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都遠離其它微生物而單獨生長為菌落，從而得到純種?？赏ㄟ^控制營養成分、培養基pH、添加抑制劑、培養溫度、通氣條件及熱處理來提高篩選效率。4生產性能的測定生產性能的測定可分為初篩和復篩。篩選時培養條件確定是關鍵，培養基的組成、通風量、pH值、培養溫度應根據菌株性能、產物代謝途徑、類似產品的培養條件以及前人經驗等到進行綜合考察，慎重選定。一般來說，初篩時，一株一瓶，根據測定結果取其中10~20%進行復篩，復篩一般一株三瓶，進一步淘汰后可作幾種培養條件的嘗試，直至留下屢次考察生產性狀好的3~5株菌株。工業菌種的育種：是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現存的優良性狀強化，或去除不良性質或增加新的性狀。二微生物的育種工業菌種育種的方法誘變基因轉移基因重組1誘變育種以微生物的自然變異作為根底的生產選種的機率并不很高。誘變育種：以誘發突變為根底的育種，是迄今為止國內外提高菌種產量、性能的主要手段。誘發突變是指用各種物理和化學等因素人為的使誘變對象細胞內的遺傳物質發生變化物理誘變劑物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子等。物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很平安。其他的幾種射線都是電離性質的，有一定的穿透力，一般都由專業人員在專門的設備中使用，否那么有一定危險性。紫外作用光譜正好與細胞內核酸的吸收光譜一致，因此，在紫外線光的作用下能使DNA鏈斷裂、DNA分子內和分子間發生交聯，從而導致菌體的遺傳性狀發生改變。紫外線誘變枯草芽孢桿菌化學誘變劑化學誘變劑：如甲基磺酸乙酯〔EMS〕、亞硝基胍〔NTG〕、5-氟尿嘧啶、秋水仙堿、亞硝酸、氮芥等。它們作用于微生物細胞后，能夠特異的與某些集團起作用，即引起物質的原發損傷和細胞代謝方式的改變，失去親株原有的特性，并建立起新的表現。甲基磺酸乙酯亞硝基胍5-氟尿嘧啶秋水仙堿表2.1各種化學誘變常用的濃度、處理時間等參考資料表2.2菌種選育常用誘變劑基因轉移是用物理的、化學的或生物學的方法將目的基因導入受體細胞并使之表達的一種技術。包括橫向和縱向兩個方向：縱向傳遞即通過繁殖進行的親代和子代的基因傳遞；橫向傳遞：是指在差異生物個體之間，或單個細胞內部細胞器之間所進行的遺傳物質的交流。2基因轉移3基因重組發生在生物體內(如減數分裂中異源雙鏈的核酸交換)和在體外環境中用人工手段使不同來源DNA重新組合的過程。出發菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養別離和篩選2

誘變育種的步驟(一)出發菌株的選擇〔1〕自然界新別離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易到達好的效果?！?〕在生產中經生產選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發菌株?！?〕每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往屢次誘變能積累較多的提高。〔4〕出發菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發菌株留作繼續誘變?！?〕要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發誘變細胞，這是由于變異性狀大局部是隱性的，特別是高產基因。〔6〕根據采用的誘變劑或根據細胞生理狀態選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處理會使細胞產生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養細胞，就要選對數期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態的、活力類似的菌懸液，為此要進行適宜培養基的培養，并要離心，洗滌，過濾。(三)誘變處理根據前面有關誘變劑及誘變處理的介紹，結合誘變對象的實際，設計誘變處理方案。(四)中間培養讓變異處理后細胞在液體培養基中培養幾小時，以讓細胞的遺傳物質復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現出來，假設不經液體培養基的中間培養，直接在平皿上別離就會出現變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩定和將來的菌株退化。(五)別離和篩選篩選分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的到達初步要求的別離菌落為目的，以量為主。復篩那么是精選，以質為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產物與某些染料或基質的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者，而將90%的菌落淘汰。在數量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株，最后才能選得優秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷結合自然別離，純化菌株。第四節工業微生物菌種的保藏微生物菌種保藏的根本原理根據微生物生理、生化特點，人工地創造條件，使微生物處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態。特點：低溫、枯燥、缺氧。一斜面保藏法和穿刺保藏法1

斜面保藏法方法：當微生物在適宜的斜面培養基和溫度條件下生長良好后，一般在5℃左右可保藏3~6個月，到期后重新移種一次。特點：適用范圍廣〔細菌、真菌和放線菌〕，但傳代多了容易發生變異，同時污染時機也增加。2

穿刺保藏法方法：將培養基制成軟瓊脂，裝入小試管內，滅菌后用接種針將菌種穿刺接入培養基中，生長旺盛時覆蓋2~3mm的無菌液體石蠟。菌種可在冰箱中保藏半年至一年。特點：有些真菌可保藏10年，適于形成孢子能力很差的絲狀真菌，對固氮菌、雙歧桿菌、沙門氏菌、毛霉、根霉等不適宜。二枯燥保藏法〔沙土管法〕方法：在小試管內盛入土壤或砂子，121℃滅菌2~3次，細菌參加濃的懸液，真菌和放線菌可直接刮下孢子勻和〔載體濕潤〕，將小試管放入真空干空器或在枯燥器中參加五氧化二磷，試管口可熔封或用石蠟封口，置于5℃保藏，其保藏期一般為兩年，有些可達10年。特點：此法適用于形成芽孢的細菌、形成孢子的絲狀真菌和放線菌，存活期短。三懸液保藏法方法：在將微生物懸浮于不含養分的溶液中，如蒸餾水、磷酸緩沖液或生理鹽水中保藏，大局部能保藏一年或更長。特點：此法適用于絲狀真菌、酵母及腸道細菌。四冷凍枯燥保藏法----比較常用1保藏原理在將微生物或孢子冷凍，然后在減壓情況下利用升華現象除去水分，使細胞的代謝、生理等生命活動處在停止狀態下進行長期保藏。2保藏方法〔一〕安瓿管的準備將安瓿管洗凈后枯燥，滅菌后，再在60℃烘箱中枯燥。〔二〕分散劑的準備其作用是盡量減少冷凍枯燥時對微生物引起的損傷。常用的分散劑有脫脂牛乳和血清。〔三〕收集菌種培養時間要掌握在生長后期，因為對數生長期的細菌對冷凍枯燥的抵抗力較弱，產孢子的微生物需適當延長培養期以得到成熟的孢子。在無菌條件下用毛細滴管參加到滅菌好的安瓿管中，每個安瓿管裝量約為3~4滴。〔四〕冷凍裝入懸液的安瓿管應立即冷凍，冷凍溫度達-30℃即可?！参濉痴婵湛菰锢鋬鼋Y束后應立即進行真空枯燥?！擦嘲碴彻艿娜鄯馊鄯馐窃诘诙纬檎婵涨闆r下，在多孔管道上進行?！财摺硺撕炘诎碴彻軠缇皡⒓佑芯?、日期的小紙片?！舶恕嘲碴彻艿谋２乩浒碴彻軕糜?~5℃下低溫保藏，保藏期一般可達5~10年?！簿拧嘲碴彻艿膯⒎庠跓o菌條件下，將熔封口處在火焰上稍加熱，立即加上1~2滴無菌蒸餾水，使玻璃產生裂縫，輕擊即可斷落。一般使用經過復壯的第二代菌種。五液氮保藏法方法：在將濃的懸液參加滅菌后的分散劑中，參加濃度為10%的甘油或5%的DMSO作為防凍的保護劑，熔封后開始降溫至-25℃。將安瓿管保藏至-196℃的液氮中。此法一般可保藏2~3年，有時可達9年。特點：效果好、方法簡單、保藏對象廣泛，但不能發送菌種。六低溫保藏法方法：在密封性能好的螺旋口小管中參加1~2mL的菌液，真接放入低溫冰箱中保藏。一般低溫時效果好。特點：保藏期一般為一年左右，有些菌可達10年，但要注意防止斷電。第五節工業微生物菌種的擴大培養一微生物的培養方法1外表培養外表培養：將微生物接種在固體或液體培養基外表，在恒溫條件下進行靜置培養的方法。如固體斜面培養、固體平板培養、液體外表生長。特點：外表的微生物既能與空氣接觸，又能與培養基接觸吸收營養，多用于實驗室。2

固體培養固體培養：將微生物接種在固體培養基上。特點：設備簡單、投資少，適合于小規模生產，但占地面積大，勞動強度大，產品質量不太穩定。3液體深層培養----多用于工業生產液體深層培養：把菌種接種到發酵罐中，使菌體細胞游離懸浮在液體培養基中，并進行生長的一種培養方法。深層液體培養一般需要通入空氣并進行攪拌。特點：可根據微生物需要合理調節生長條件，把微生物的生長、代謝控制在最正確狀態而收到較好的培養效果。二菌種的擴大培養種子擴大培養是指將保存在砂土管、冷凍枯燥管中處休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養,最終獲得一定數量和質量的純種過程。這些純種培養物稱為種子。種子擴大培養的概念:1概述種子擴培的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發酵時間、保證生產水平種子的要求：

總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩定，個體與群體

活力強，移種至發酵后，能夠迅速生長

無雜菌污染2種子的制備過程實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養過程一般都在菌種室完成，因此現象地將這些培養過程稱為實驗室階段的種子培養。生產車間階段：種子培養在種子罐里面進行，一般在工程歸為發酵車間管理，因此形象地稱這些培養過程為生產車間階段。3斜面菌種的培養4一級種子的培養----搖瓶生產通常在無菌室內進行。生產中使用的斜面菌種不宜屢次移種，一般只移接三次，防止由于菌種的自然變異引起菌種的不純。一級種子的培養通常用三角瓶進行液體恒溫振蕩，也稱搖瓶。三角瓶中的菌種由斜面培養的種子接入。在某些發酵產品中，一級種子不用三角瓶，而是培養大型斜面〔茄子瓶斜面〕作為一級種子使用。5二級種子的培養----種子罐生產一種子罐的大小根據發酵產品和發酵罐的容積配套確定?！踩?%〕種子罐種子培養成熟后，需要檢驗種子的質量，如細胞形態、pH值。在原料方面：不如實驗室階段那么精細，而是根本接近于發酵培養基，這有兩個方面的原因:一是本錢；二是馴化。6種子罐級數定義：制