65.150CCS

B

5222 DB

22/T

3298—2021淡水魚腸道常見致病菌分離與純化技術規程Technical

of

practice

of

pathogenicbacteria

of

bacteria

fish吉林省市場監督管理廳 發

布DB

22/T

3298—2021 本文件按照GB/T

1.1—2020《標準化工作導則

第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件中的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由吉林省農業農村廳提出并歸口。本文件起草主要單位：吉林農業大學、通化師范學院、吉林省水產技術推廣總站。本文件主要起草人：張東鳴、陳玉珂、王秋舉、郭志欣、藺麗麗、劉洪健、趙云龍、吳振超。

0

kg/cm

～

3

0

kg/cm

～

3

kg/cm

4

℃

～

1 范圍和記錄等。本文件適用于淡水魚腸道常見致病菌的分離與純化。2 規范性引用文件文件。GB

4789.28食品微生物學檢驗

培養基和試劑的質量要求SN/T

2632—2010 微生物菌種常規保藏技術規程3 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。腸道致病菌

intestinal

pathogenic

bacteria存在于魚類腸道中可以導致魚類發生疾病的細菌。Staphylococcus

aureusAeromonashydrophila）、大腸桿菌（Escherichia

coli）、維氏氣單胞菌（Aeromonas

veronii）、愛德華氏菌（EdwardsiellaAeromonas

sobria4 實驗器具超凈工作臺、顯微鏡（10

倍

×

倍）、解剖鏡、離心機（RCF

10

×g

～

30

×g）、2 2對精度

1/1000

mL

和1000

mL

mm）、玻璃試管（25

mL5 試劑和培養基試劑試劑為

75

%

乙醇，0.7

%

生理鹽水，試劑均為分析純。序號成分用量1胰蛋白胨10.0

g2酵母提取物5.0

g3氯化鈉10.0

g4瓊脂15.0

g5蒸餾水1000

DB

22/T

3298—2021培養基固體和液體培養基按表

1

執行。瓊脂僅在制作

LB

固體培養基時添加，培養基質量要求符合

4789.28

的規定。表

1

表

1

培養基器具消毒

菌

20

min。制備平板6.2.1 培養基滅菌將

培養基置于錐形瓶中經高壓蒸汽滅菌(

℃

20

min)后放置于提前滅菌的無菌操作臺中，待培養基溫度不燙手且未凝固時開始倒制平板。6.2.2 倒制平板6.2.2.1一只手拿錐形瓶，靠近酒精燈火焰，另一只手拔出棉塞；使錐形瓶瓶口迅速通過火焰，此步驟重復

2

次

～

3

次。6.2.2.2 將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，輕輕倒入厚度為

3

～

5

mm

LB

培養基，將培養皿上蓋半掩放置。6.2.2.3 整個倒制平板過程均在超凈工作臺中進行。6.2.3 平板冷卻待培養皿中培養基溫度降至室溫后，蓋上蓋子，備用。7 分離純化流程圖DB

22/T

3298—2021分離和純化步驟見圖

1。取樣（見7.2）制備懸液（見7.3）檢驗純度（見7.7）圖1分離與純化步驟取樣選取具有典型癥狀的瀕死病魚作為分離腸道致病菌的對象。用

75

%

的酒精棉球對魚體體表消毒后，打開腹腔，再用

75

%

酒精棉球擦拭腸管外壁，將整個腸道取出，分離前腸、中腸和后腸，備用。制備懸液7.3.1 用約

2

倍腸道內容物體積的無菌生理鹽水將腸道內容物沖入無菌離心管中，制成細菌懸液。7.3.2 將

7.3.1

的細菌懸液在無菌條件下涂布在

LB

培養基上

28

℃

～

37

℃

24

h，觀察菌落的生長情況。7.3.3 根據

7.3.2

的實驗結果，在無菌條件下采用無菌的生理鹽水將

7.3.1

的細菌懸液稀釋成不同倍數的稀釋菌液。建議稀釋倍數為：10

、10

倍數的稀釋菌液。建議稀釋倍數為：10

、10

和

-5

。接種分別取

7.3.3

0.1

，在酒精燈外焰附近采用滅菌的涂布棒將菌液均勻涂布在

培養基上，至液體全部被培養基吸收,每個濃度的菌液做

3

個重復。例次品種魚體特征取樣地點取樣時間取樣部位菌液濃度獲得菌株數量123DB

22/T

3298—2021培養在培養皿上蓋表面標注樣品名稱、日期和采樣地等信息。置于恒溫培養箱中

28

℃

～

37

℃

倒置培養

24

h。純化7.6.1 劃線分離在無菌條件下，采用接種環挑取同一培養皿中不同顏色和不同形態的單個菌落在無菌

LB

℃

～

37

℃

培養

24

h。7.6.2 純化時機重復

7.6.1

操作

2

～

3

次。待培養基上均勻的長出顏色和形態相同的單個菌落時便可以進行細菌的純化培養。7.6.3 純化培養采用無菌的接種環將挑取的單個菌落接種于裝有無菌的

液體培養基試管中，在試管上標注樣品名稱、日期和采樣地等信息，然后將試管置于恒溫振蕩器中，在溫度

28

℃

～

37

℃，轉速每分鐘120

h

～

18

h。檢驗純度培養結束后按照

和

7.5

的方法再進行分離培養，若新平板中長出不同顏色或不同形態的菌落，