對一起聚集性發熱伴血小板減少綜合征的研究及該病病毒載量與病情相關性研究背景發熱伴血小板減少綜合征(SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromeSFTS)是我國在2009年首次發現的新發病毒性傳染病,病死率為高達30%。SFTS目前考慮是發熱伴血小板減少綜合征病毒(Severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus,SFTSV)感染導致。其主要臨床表現為發熱、血小板減少、白細胞減少以及胃腸道癥狀等,少數重癥患者可因多臟器損害而死亡。目前2011年至2014年全國23個省共報告SFTS5352例,其中16個省報告確診病例2750例,以河南、湖北、山東等地高發。而且類似病例在日本、韓國和美國均有報道。部分SFTS患者發病前有蜱蟲叮咬史。此外考慮SFTSV在人與人之間傳染存在,從2007年至2015年,在河南、江蘇、遼寧、山東、安徽、河北、浙江、以及韓國均有SFTS聚集性案例報道。目前考慮人與人之間傳染的主要危險因素是直接接觸患者的血液。而其他潛在的接觸途徑如尿、糞、呼吸道分泌物等的暴露因素在人與人之間傳播的關系不大。近年來,在少數SFTSV感染的聚集性病例中有隱性感染的報道,表明人傳人SFTSV感染可以是隱性感染,但應進一步研究。SFTSV具有廣嗜性,可感染肝、肺、腎等多種器官。SFTS臨床表現多樣,可累積多個器官。多以驟然發熱起病,表現為食欲不振、乏力、惡心嘔吐等消化道癥狀、淋巴結腫大、血小板減少、白細胞減少等癥狀。可出現中樞神經系統癥狀如淡漠、嗜睡、震顫、驚厥和昏迷等,及出血表現如瘀點、瘀斑、注射部位血腫、嘔血、便血、血尿和陰道出血。并可出現生化和其他實驗室檢查異常,如血清ALT、AST、GGT、LDH、CK、CK-MB和血糖的升高,嚴重病例出現多臟器功能衰竭和DIC。而SFTSV在人體內存在的時限,與病情及預后的相關性,目前報道罕見。本研究主要分出兩個部分:1.對一起聚集性發熱伴血小板減少綜合征病例進行研究;.2.對SFTSV載量與患者的病情進行相關性研究。以進一步了解SFTS的傳染機制,提高臨床醫師對本病的認識,以對SFTS的臨床診治和防護做出指導。第一部分對一起聚集性發熱伴血小板減少病例綜合征病例的研究目的1.研究可能導致發熱伴血小板減少綜合征(SFTS)人與人之間傳染的接觸方式及對其進行評估。2.對SFTS隱性感染患者的傳染方式進一步研究,以對SFTS的臨床診治和防護做出指導。方法1.收集2014年7月山東省發生的一起疑似聚集性發熱板血小板減少綜合征的6個病例(病例A、病例B、病例C、病例D、病例E、病例F)的臨床資料和樣本。并對患者及其密切接觸者或家屬進行了居住環境、蜱蟲叮咬史、動物接觸史、可能暴露途徑、是否采取了保護性措施等的流行病學調查。2.從病例A的血涂片的刮取物提取總RNA用于巢式RT-PCR檢測。其余5例患者的血樣標本采集離心后吸取血清上清液保存于-70℃直至用于提取病RNA。3.使用TRIzol提取血清中的總RNA。4.逆轉錄合成cDNA后,分裝后保存于-80℃冰箱。5.針對SFTSV基因組的S、M、L片段分別設計兩對內嵌式簡并引物,進行巢式RT-PCR,擴增樣本中SFTSV的S、M、L的部分片段。6.PCR產物使用瓊脂糖膠電泳,用凝膠成像儀觀察并回收。7.將特異性PCR片段純化測序,測序結果經過DNAStar軟件中的Seqman進行拼接,通過序列比對分析進一步確認上述病例中SFTSV感染情況。8.將確認為SFTSV陽性的血清樣本接種DH82細胞,收獲各代次培養上清離心棄去細胞碎片沉淀,分裝至細胞凍存管至于-80℃凍存。9.取各代次細胞培養上清,提取總RNA后逆轉錄為cDNA,RT-PCR方法檢測培養上清中病毒并分離擴增。10.PCR檢測為陽性的細胞上清1ml與DH82細胞孵育,用間接免疫熒光法(IFA)檢測細胞中病毒蛋白的表達。11.對分離到的病毒進行全基因序列的測定。12.使用間接免疫熒光法(IFA)和細胞ELISA(cELISA)的方法對采集的血清樣本中抗SFTSV特異性IgM及IgG的水平進行檢測。13.使用抗體中和實驗(MNA)對血清中中和抗體進行測定。14.將純化后的PCR陽性產物進行克隆測序。將測定的核酸序列用DNAstar軟件的SeqMan進行拼接和校對;利用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進行序列比對,用Mega5.0中的最大相似度法構建進化樹,對各患者或密切接觸者血清樣本的PCR產物片段的核酸序列和分離到病毒的基因組序列進行對比和進化分析,從遺傳學的角度揭示該聚集性SFTS病例的人與人之間傳染的可能。結果:1.病例A在入院第二天死于多臟器功能障礙;給于病例B支持治療、輸注血小板、皮下注射粒細胞集落刺激因子等后,治療無效病情惡化,于發病第10天死亡;病例C給于對癥支持治療后,病情好轉,于發病14天痊愈出院;密切病例D、E和F接觸患者后無一發病。病例A、B、C均有發熱伴血小板減少,其中病例A和病例B還伴有白細胞減少。2.病例B和病例C都直接接觸了病例A的血液和皮膚黏膜并污染了衣物,病例A整個過程中和事后未采取任何保護措施,而且事后繼續穿沾了血液的衣物照顧病例A,而病例C事后把他沾了血液的衣服扔了,然后洗了雙手,洗了個澡。病例D接觸過C,病例E接觸過B,病例F均接觸過B和C。病例D、E、F均接觸過患者的皮膚、黏膜和體液,病例D和病例E未采取任何保護措施,而病例F帶了口罩而且后來洗手了。可推斷聚集性病例中SFTSV可能的傳播路線是從原發患者(病例A)至繼發患者(病例B和病例C),然后是從病例B至病例E和病例F,病例C至病例D和病例F。3.病例A的血涂片及病例B的血樣中檢測到SFTSV的RNAS片段(1160-1513nt)及L片段(589-806nt),但是在病例C的血樣中未檢測到上述片段。病例D的血樣中未檢測到SFTSV的RNA片段,但是在病例E和病例F的血樣中檢測到SFTSVRNA的L片段。4.通過cELISA我們可以檢測到病例B、病例C、病例D、病例E及病例F的血樣中有不同滴度的IgM水平;而通過IFA,我們只檢測到病例E和病例F的IgM陽性。5.通過cELISA我們可以檢測到病例B和病例C有低滴度的IgG;而通過IFA檢測到病例B的血樣IgG陽性。6.MNA顯示從病例B血樣中分離到的病毒可以和病例E和病例F的血樣起反應,發生中和作用。7.病例B的PCR產物S和L片段(分別為354bp和218bp)的序列和分離出病毒序列完全一致。病例A的PCR產物S片段(199bp)有99.5%的核酸序列與病例B的一致,而且病例A的PCR產物L片段(218bp)與病例B的完全一致。8.系統進化分析顯示:分離出的病毒的S序列與病例A和病例B的PCR產物序列聚集在一起。此外,病例E和病例F的PCR產物L片段與病例A及病例B的及分離到的病毒序列完全一致。因而我們考慮病例A、B、E、F和分離到的病毒有共同的起源。結論1.SFTSV因為血液暴露從原發患者傳染至繼發患者。2.3位SFTSV隱性感染者為近期的感染,考慮是因接觸繼發患者的體液及粘膜所致。第二部分發熱伴血小板減少綜合征病毒載量與病情相關性研究目的:1.探討發熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)在人體內存在的時限。2.研究SFTSV病毒載量與病情的嚴重程度及預后的相關性。方法:1.自2015年5月至2016年10月,在威海市中心醫院感染性疾病科收集住院SFTS患者血樣標本125例。標本采集離心后吸取血清上清液保存于-70℃直至用于提取病毒RNA。并對其中46例患者入院期間連續采取血清。2.收集臨床資料包括有無合并癥,包括神經系統癥狀(包括淡漠、嗜睡、昏迷、抖動、抽搐等)、出血傾向(包括皮膚瘀點、肺出血、柏油樣便、彌散性血管內凝血)、嚴重心肌損害(CK-MB>2倍正常值上限)及肺炎的發生率。3.收集患者的實驗室指標:白細胞、血小板、肝功、腎功、心肌酶、電解質、血凝常規。4.提取血樣標本中的病毒RNA,提取后收集到無菌EP管中待用。5.采用實時熒光定量PCR的方法對提取的病毒RNA檢測SFTSV載量。6.其中46例進行SFTSVRNA的動態分析,觀察SFTSVRNA在人體內存在的時限及與病情的相關性。7.根據SFTSVRNA定量分成低病毒載量組(<104copies/mL)和高病毒載量組(≥104copies/mL),對比分析兩組并發癥發的發生率和實驗室指標的差異,及與預后的相關性。8.使用SPSS17.0軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料用x±s表示,非正態分布的計量資料采用中位數(M)和上下四分位數表示(P25,P75),計數資料用例(百分率)表示;方差齊采取t檢驗,方差不齊采取秩和檢驗。結果:1.一般資料:125例患者男64例,女61例,平均年齡(59.0±3.6)歲,治愈101例,死亡24例。2.兩組SFTSVRNA定量比較:低病毒載量組81例,SFTSVRNA載量為(3.08±1.01)拷貝/mL,高病毒載量組有44例,SFTSVRNA載量為(5.69±0.99)拷貝/mL,兩組比較差異有統計學意義(t=11.78,P<0.05)。3.對46例患者進行SFTSV的動態檢測,顯示發病1周后大多數患者的病毒量開始下降,至發病23天后,均轉為陰性。4.兩組神經系統癥狀、出血傾向、嚴重心肌損害及肺炎的發生率分別為4.76%、0%、0%、2.47%和90.9%、40.9%、70.5%、68.2%,兩組比較有統計學意義(χ2=92.987、38.711、75.889、54.680,均P<0.05)。死亡患者病毒載量在1.06×104~5.78×107拷貝/mL之間。5.125例患者WBC總數均減少,為(0.67～3.91)×109/L,<104cop/ml組和≥104cop/ml組的WBC總數分別為(2.35±1.03)×109/L和(1.94±0.97)×109/L,兩組比較差異無統計學意義(t=0.181,P>0.05)。6.125例患者PLT總數均減少,為(10～88)×109/L,兩組PLT總數分別為(58±21)×109/L和(38±22)×109/L,兩組比較差異有統計學意義(t=2.869,P<0.05)。7.兩組患者肝功、腎功能比較:1.兩組的ALT、BUN、Cr、UA比較差異無統計學意義(Z/t=-1.019,-0.702、-1.212、1.892,均P>0.05);2.兩組的AST、GGT比較差異有統計學意義(Z/t=-2.612、-2.015,均P<0.05)。8.兩組的肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脫氫酶和羥丁酸脫氫比較差異均有統計學意義(Z=-1.985、-3.279、-3.126、-2.152,均P<0.05)。9.兩組的電解質及血糖比較:1.兩組的血鈉、血鈣和血糖比較差異均有統計學意義(Z/t=2.666、2.612、-2.321,均P<0.05);2.兩組的血鉀和血氯比較差異均無統計學意義(z/t=1.4