電刺激海馬ca1區、ghrp-6對大鼠下丘腦室旁核胃牽張神經元放電活動的影響

海瑞是邊緣系統的一個重要整合中心，主要參與認知、學習和存儲功能的調節。近年的研究表明,海馬在攝食、胃運動、能量代謝的調節中同樣發揮著重要的作用。形態學研究表明,海馬與杏仁核、下丘腦、延髓等中樞腦區有著豐富的纖維聯系,這些神經核團共同作用,通過對內臟傳入傳出信號的整合處理,完成對攝食相關功能的調控。下丘腦室旁核(PVN)是中樞內調節能量代謝的重要腦區,是消化功能傳入傳出信息的重要轉換站。PVN內的多種神經肽參與攝食行為和能量平衡的調節,主要包括NPY、ghrelin、motilin等。其中ghrelin是1999年發現的一種由28個氨基酸組成的腦腸肽,是一種生長激素促分泌激素受體(GHSs-R)的內源性配體。ghrelin除了分布在胃、腸、胰、腎等外周組織器官之外,在下丘腦、垂體等中樞部位亦有表達,主要參與攝食、能量平衡、胃酸分泌等的調378青島大學醫學院學報48卷節。海馬作為高一級的調控中樞,是否可以通過調控下丘腦PVN神經元的活性進而對攝食和胃運動進行調節,這一神經通路是否有ghrelin的參與,至今未見報道。本研究采用核團微量注射及神經元細胞外記錄方法,探討ghrelin在海馬-PVN調控通路中的作用,為中樞ghrelin調控腦功能的研究提供新的實驗依據。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1體質量、飼養時間健康成年雄性Wistar大鼠(由青島市藥檢所提供)89只,體質量250~350g,置于室溫(25±2)℃、12h-12h晝夜循環光照條件下飼養,自由攝食、飲水。實驗前適應性飼養1周。1.1.2電子刺激器、微電極放大器、u3000ew-4001mez-4001自制雙極刺激電極(除尖端0.1mm外均絕緣,極間距0.5mm);SSEW-3301電子刺激器、MEZ-8201型微電極放大器、VC-Ⅱ型雙道記憶示波器和SUMP-PC生物電信號處理系統,均由日本光電公司生產。ghrelin、[D-Lys-3]-GHRP-6和熒光金(FG)購自美國Sigma公司。1.2實驗方法1.2.1胃牽張抑制腦牽張大鼠用200g/L烏拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉,頸部正中縱行切口,行氣管插管術。胃部手術:腹部正中縱行切口,經胃底部切口將胃內容物取出,以溫生理鹽水清洗。置入一薄軟膠氣囊,經聚乙烯軟管連至一支5mL注射器,實驗中注入生理鹽水(3~5mL,0.5mL/s,37℃)擴張胃,用以鑒別胃牽張(GD)敏感神經元,縫合腹部。頭部手術:頭部正中切口,牙科鉆顱骨鉆孔,插入刺激電極至海馬CA1區,定位參照Paxions-Watson大鼠腦圖譜(前囟后3.4mm,L(R):1.6mm,H:3.0mm);刺激參數:強度0.1mA,頻率50Hz,波寬1ms,刺激時間5s。在PVN對應顱骨表面位置鉆孔,覆蓋20g/L瓊脂生理鹽水與顱骨表面平齊,以保護腦皮質及作為顱骨表面定位標志;施行小腦延髓池穿刺術引流,以減少腦波動對微電極位置的影響。1.2.2gd-i神經元/gs-i神經元/gs-i神經元的檢測采用三管玻璃微電極(電極尖端總直徑約3~10μm,電極阻抗5~15MΩ),其中一管作為記錄電極,其內充灌20g/L滂胺天藍溶液,另外兩管分別充灌1.5×10-8mol/Lghrelin,2.8×10-8mol/L[D-Lys-3]-GHRP-6或生理鹽水。通過監聽器判斷電極尖端進入空氣與瓊脂界面,用液壓推進操縱器將微電極送至PVN(前囟后1.3~2.3mm,中線旁開0.5~0.8mm,距離顱骨表面7.7~8.4mm)區域內,鑒別GD敏感神經元,以神經元放電頻率的變化率超過20%作為神經元興奮或抑制標準,神經元表現興奮的確定為GD-E神經元,表現為抑制的確定為GD-I神經元。觀察細胞電信號與噪聲比在3∶1以上,進行細胞外放電記錄。由PM2000B4-channelProgrammablePressureInjector(MDI,USA)壓力給藥系統經三管玻璃微電極的另外兩管給藥,觀察神經元放電頻率的改變,或電刺激海馬CA1區,觀察PVN內GD敏感神經元電活動的改變。信號經MEZ-8201型微電極放大器輸入VC-Ⅱ型雙道示波器,電信號經由示波器同步Y軸輸出,經SUMP-PC生物信號處理系統進行放電頻率分析,并繪出序列密度直方圖。1.2.3微電泳標記每次實驗結束后,微電極接陰極,無關電極接陽極,以電流強度為10μA的直流電通電20min,通過微電泳使電極內的滂胺天藍泳入腦組織,標記微電極所在位置;先后用生理鹽水和40g/L甲醛溶液經左心室灌流,快速斷頭取腦,置于40g/L甲醛溶液內浸泡2d,做50μm系列冠狀切片,中性紅染色,檢查電極記錄位置,位置不準確的資料不列入統計。1.3兩組放電頻率的比較各組神經元放電頻率以xˉ±sxˉ±s表示,細胞給藥前后放電頻率比較采用配對t檢驗,兩組數據比較采用成組t檢驗,P<0.05認為差異有統計學意義。2結果2.1grtelin神經元在海馬調控臟器相關藥物活動中的表達在89只大鼠的PVN共記錄到109個神經元單位放電,胃牽張刺激可以興奮其中的71個神經元(72.5%),神經元平均放電頻率由(2.48±0.39)Hz增加至(3.69±0.62)Hz(t=2.89,P<0.01),鑒定為GD-E神經元;另外有38個神經元對胃牽張刺激表現為抑制反應,神經元的平均放電頻率由(1.65±0.21)Hz下降至(0.91±0.19)Hz(t=3.41,P<0.01),鑒定為GD-I神經元。在71個GD-E神經元中,微量注射ghrelin可興奮其中51個神經元(72%),放電頻率由(2.04±0.44)Hz增加至(2.60±0.48)Hz,放電頻率平均增加(38.9±7.3)%(t=2.85,P<0.01),與生理鹽水5期齊玉霞,等.ghrelin在海馬調控下丘腦室旁核胃牽張敏感神經元活動中作用379組的(2.10±0.55)Hz(n=45)相比差異有統計學意義(t=2.21,P<0.05);另外有18個神經元放電頻率無明顯變化,有2個神經元在給予ghrelin后出現抑制反應。ghrelin興奮的神經元,在給予ghrelin受體阻斷劑[D-Lys-3]-GHRP-6后,再給予ghrelin,興奮反應不再出現。在38個GD-I神經元中,微量注射ghrelin可抑制其中23個神經元(60%),放電頻率由(1.53±0.39)Hz下降至(0.65±0.15)Hz,平均減少(45.2±6.3)%(t=3.08,P<0.01),與生理鹽水組的(1.49±0.51)Hz(n=21)相比差異有顯著性(t=2.57,P<0.05);另外有12個神經元的放電頻率無明顯變化,有3個神經元出現興奮反應。ghrelin抑制的神經元,在給予ghrelin受體阻斷劑[D-Lys-3]-GHRP-6后,再給予ghrelin,抑制效應不再出現(圖1)。2.2神經元放電頻率在41個對ghrelin有興奮反應的GD-E神經元中,電刺激海馬CA1區,可興奮其中16個神經元(39%),神經元放電頻率由(2.67±0.57)Hz增加至(3.54±0.69)Hz,平均增加(78.9±11.6)%(t=3.95,P<0.01),其余神經元的放電頻率無明顯變化;在15個對ghrelin有抑制反應的GD-I神經元中,電刺激海馬CA1區可以興奮其中5個GD-I神經元(33%),神經元放電頻率由(2.15±0.69)Hz增加至(2.85±0.82)Hz,平均增加(51.4±9.3)%(t=6.05,P<0.01),其余神經元的放電頻率無明顯變化(圖2)。2.3第一次電刺激海馬在電刺激海馬CA1區后,有興奮效應的16個GD-E神經元中,給予[D-Lys-3]-GHRP-6后,再次電刺激海馬,有7個神經元(44%)的放電頻率與第一次給予電刺激后相比明顯降低((86.3±15.4)%vs(51.2±10.7)%;t=2.97,P<0.05)。而在電刺激海馬后有抑制反應的5個神經元中,給予[D-Lys-3]-GHRP-6后,再次電刺激海馬,神經元的興奮效應無明顯變化((41.8±8.5)%vs(45.1±9.3)%;t=0.92,P>0.05)(圖2)。3grtelin調控pvn的神經元/傳導束GD可興奮胃壁機械性感受器,興奮通過迷走傳入纖維上傳至延髓、下丘腦及其他腦區如海馬、杏仁核、皮質等,引起進食后系統性的情緒、心理及自主神經系統的活動反應。電生理學上利用對GD的電應答反應,鑒定消化道機械感受性傳入信息的神經途徑,用以研究參與調控胃腸功能的中樞部位及影響其活動的神經體液因素。中樞內的一些腦腸肽,如motilin、ghrelin、nesfatin-1等可以通過改變腦內的GD敏感神經元的活性,進而影響到胃運動和攝食活動。本實驗結果顯示,GD可以通過外周神經上傳至PVN,在PVN記錄到對GD表現為興奮反應的GD-E神經元和表現為抑制反應的GD-I神經元。已有的資料顯示,PVN內有ghrelin受體的表達。本實驗表明,外源性ghrelin微量注射可以興奮PVN內的GD-E神經元,抑制GD-I神經元,且這種作用可以被ghrelin受體阻斷劑所阻斷,說明其作用是通過ghrelin受體介導的。PVN與邊緣系統的杏仁核、海馬及延髓孤束核、迷走運動背核等胃腸功能調節中樞都有明確的神經投射聯系。因此推測,ghrelin改變PVN內的GD敏感神經元的興奮性,這些神經元將信號傳導至與PVN有神經纖維聯系的其他中樞腦區,這些攝食相關中樞整合信號,產生相關情緒、心理反應,最后通過迷走神經作用于外周胃腸道,完成對攝食和胃運動的調控。380青島大學醫學院學報48卷研究顯示,海馬可以通過對攝食相關信號的處理,參與胃運動和攝食功能的調控。損毀大鼠海馬,可以引起大鼠攝食量和體質量的增加。海馬內可記錄到和GD相關的神經元,且該類神經元的興奮可以調節清醒大鼠胃運動。本文電生理實驗結果顯示,電刺激海馬CA1區可以興奮PVN的GD敏感神經元,且這種作用在一定程度上可以被ghrelin受體阻斷劑所阻斷。提示海馬CA1區可通過與其下位中樞PVN的相互作用,進而影響到胃運動及攝食活動,且ghrelin能神經通路參與了這種調控的完成。由于海馬與皮質、杏仁核、下丘腦及延髓之間有著廣泛的纖維聯系且以上核團與PVN之間也存在相互的纖維投射,所以不能排除電刺激海馬CA1區所引起的PVN內神經元的電活動改變是通過以上神經中樞的介導而引起的間接反應。本研究結果還顯示,g