姜黃素對急性脊髓損傷大鼠運動功能的影響

氧氣反應應激活急性髓質傷理過程中的重要作用。因此，抗旱性損害是急性髓質傷理治療的熱點。在機體中,核因子E2相關因子2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2,Nrf2)/抗氧化反應原件(antioxidantrespondelement,ARE)信號通路是非常重要的內源性抗氧化應激通路,它可以編碼及調節多種抗氧化基因的表達,增強細胞對氧化應激的抵抗性,從而減少氧化應激對機體造成的損害。姜黃素來源于植物姜黃的干燥根莖,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、抗纖維化等一系列藥理作用。最近有研究報道姜黃素能夠改善急性脊髓損傷大鼠的預后,但其機制卻不甚明確。本實驗采用改良的Allen’s打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型,觀察姜黃素對建模大鼠氧化應激損傷的保護作用以及對Nrf2/ARE/γ-GCS信號通路的影響,旨在探討姜黃素對大鼠急性脊髓損傷的保護作用及其機制。材料和方法1實驗試劑與模型的建立1.1SD雌性大鼠60只(重慶醫科大學實驗動物中心提供),體重200~250g;姜黃素與二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司),Nrf2抗體(Bioworld公司),γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)抗體(Santacruze公司),β-肌動蛋白(β-action)抗體(北京博奧森生物技術有限公司),鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物連接(SP)免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所),聚丙烯酰胺凝膠(SDS)配制試劑盒、電化學(ECL)發光試劑盒、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)。1.2急性脊髓損傷模型的建立采用改良的Allen’s打擊法,10%水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠,將大鼠俯臥,固定于鼠板上,摘除T9~T10椎板,暴露脊髓,用自制改良的Allen’s打擊器以50g/cm(重量為10g的擊打棍從5cm高空自由落體)的致傷能量造成脊髓急性損傷,撞擊成功標志為:撞擊脊髓組織水腫、出血,硬脊膜完整,但呈紫紅色,大鼠尾巴出現痙攣性擺動,雙下肢軀體回縮樣撲動,呈遲緩性痙攣。模型制作成功后需每日2次擠壓膀胱排尿,直至形成膀胱反射。1.3實驗分組SD雌性大鼠60只,隨機平均分為假手術組、模型組、姜黃素低劑量組(40mg/kg,CUR-L組)、姜黃素高劑量組(100mg/kg,CUR-H組),各組均為15只。將姜黃素溶于0.1%DMSO的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中,其中姜黃素高、低劑量組在脊髓損傷前1d給予相應劑量的姜黃素腹腔注射,每日1次,持續7d。假手術組和模型組腹腔注射等體積含0.1%DMSO的PBS溶液。2檢測方法2.1運動功能方面采用脊髓損傷后后肢運動功能評分系統(BBB)評分法評價大鼠后肢運動功能,觀察其后肢的關節活動、步態等運動功能。評分共分為3個部分:第1部分評價動物后肢各關節活動(0~7分);第2部分評價動物后肢步態及協調功能(8~13分);第3部分評價動物后肢運動中爪的精細動作(14~21分),3個部分滿分共21分。評分者為非本實驗組人員且熟知BBB評分標準,每只動物均評定3次。2.2mda含量測定于設定實驗時間點麻醉處死大鼠,取損傷段脊髓組織,用4℃生理鹽水按1:9(W/V)制成10%的脊髓勻漿,將勻漿液以3000r/min離心15min后取上清液,參照試劑盒說明嚴格操作測定MDA含量。2.3蛋白凝膠的制備取脊髓組織80~100mg勻漿,RIPA裂解并用BCA法測定蛋白濃度,每組取相等蛋白量進行SDS電泳,將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,室溫下5%脫脂奶粉封閉2h,Nrf2、γ-GCS一抗稀釋比例1:1000,4℃孵育過夜;二抗稀釋比例為1:1000,37℃孵育1h,ECL發光顯色;感光膠片壓片,內參采用β-actin。以Nrf2/β-actin和γ-GCS/β-actin的灰密度比值作為目標蛋白相對表達量。2.4固定方法固定于設定實驗時間點麻醉處死大鼠,經左心室灌注肝素化生理鹽水,直至灌注液清亮后再以4%多聚甲醛灌注行在體脊髓組織固定。隨后分離脊髓組織固定于4%多聚甲醛24h,常規石蠟包埋,冠狀切面切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,樹脂封片后鏡下觀察脊髓組織病理變化。2.5胞漿用焦色表達檢測采用北京中杉金橋公司SP法免疫組化試劑盒進行染色操作,嚴格按照其說明步驟進行。Nrf2一抗稀釋比例1:100,以胞漿棕褐色為陽性表達;γ-GCS一抗稀釋比例1:50,以胞漿棕褐色為陽性表達。實驗結果由兩位專業免疫組化實驗人員進行獨立評定,采用inmagepro-plus6.0對目標蛋白進行分析,以平均吸光度值為標準對各組目標蛋白進行評定。3軟件分析數據采用xˉ±sxˉ±s表示,SPSS11.5軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析,組間進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05為有統計學意義。結果1兩組假手術組的比較假手術組評分基本正常;模型組評分顯著低于假手術組(P<0.05);CUR-L組及CUR-H組評分明顯高于模型組(P<0.05),但仍低于假手術組,見表1。2各組大鼠髓組織mda含量比較模型組大鼠脊髓組織MDA含量較假手術組明顯升高(P<0.05);CUR-L組及CUR-H組大鼠脊髓組織MDA含量較模型組明顯下降(P<0.05),但仍未達到假手術組水平,見表1。與假手術組相比:*P<0.05;與模型組相比:#P<0.053各組nrf2蛋白表達水平比較結果顯示,模型組Nrf2、γ-GCS蛋白表達水平明顯高于假手術組(P<0.05);與假手術組比較,CUR-L組及CUR-H組Nrf2蛋白表達水平逐漸增強(P<0.05);CUR-L組γ-GCS蛋白水平高于模型組(P<0.05),CUR-H組γ-GCS蛋白水平明顯高于模型組(P<0.05),見圖1,表2。與假手術組相比:*P<0.05;模型組相比:#P<0.054神經元的缺如假手術組大鼠脊髓灰白質交界清楚,無出血及水腫灶,神經元豐富,核仁清晰,無核固縮及壞死現象;模型組可見散在的出血灶,間質水腫并有空腔形成,大量炎性細胞浸潤,膠質細胞增生,正常的細胞形態嚴重破壞,細胞變性壞死嚴重,神經元大量丟失甚至缺如;CUR-L和CUR-H組與模型組相比,炎性細胞明顯減少,膠質細胞增生不明顯,細胞排列較為整齊和規則,變性壞死的細胞明顯減少,僅能夠觀察到少許細胞的核固縮現象,有較多的神經元存活;其中,CUR-H組較CUR-L組改變更為明顯,見圖2。5各組nrf2、-gcs蛋白表達水平比較免疫組化檢測結果顯示,模型組Nrf2、γ-GCS蛋白表達水平均明顯高于假手術組(P<0.05),與模型組比較,CUR-L組、CUR-H組Nrf2、γ-GCS蛋白表達水平逐漸增強,CUR-H組增高更為顯著(P<0.05),見圖3、4,表3。與假手術組相比:*P<0.05;與模型組相比:#P<0.05nrf2/關于-gcs信號通路研究表明,脊髓損傷造成的最終神經功能障礙主要由兩種機制引起的,即原發性損傷和繼發性損傷,原發性損傷多為由外力造成的機械性損傷,且產生的神經損害是不可逆的。繼發性損傷發生于原發損傷后的數分鐘到數天內,現多認為由原發性損傷造成的髓鞘和軸突的破壞、局部組織缺血、水腫、血管痙攣、微循環障礙而引發的一系列細胞內代謝和基因改變,包括局部血管的改建和缺血、炎性遞質的聚集、與脂質過氧化反應有關的自由基損傷、興奮性遞質與電解質失衡等。這些變化相互促進相互影響,會加重脊髓的損傷程度,甚至會引起原發性損傷后幸存下來的神經細胞繼發性凋亡或壞死。其中,氧化應激反應中產生的大量活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)與自由基在繼發性損傷的發生、發展上起著關鍵的作用。在評價機體氧化應激的程度時,MDA是最常用的指標之一,機體內過多的氧自由基能攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸,引發脂質過氧化作用,并形成脂質過氧化物,如MDA,因此測試MDA的含量能夠反映機體內脂質過氧化程度,間接地反映組織細胞受到氧化應激損傷的程度。本實驗中,大鼠模型組脊髓組織MDA含量顯著高于假手術組,說明損傷后大鼠的脊髓組織中存在著氧化應激損傷。當脊髓組織遭受氧化應激損傷時,細胞內抗氧化防御系統對于降低氧化應激引起的神經元損傷至關重要,其中Nrf2/ARE信號通路是迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路,Nrf2是亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家庭(CNC)家族成員,共有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈(leucimezipperbZIP)結構。生理狀態下主要在細胞質中與Keap1(Kelch-likeECH2associatedprotein1)蛋白結合,不具有轉錄活性。當受到內源性或外源性ROS等親電子物質的攻擊時,Nrf2與Keap1解離并轉位進入細胞核與與Maf蛋白結合成異二聚體后與ARE序列結合,進而啟動下游受ARE調控的抗氧化基因的轉錄,提高機體抗氧化應激的能力。到目前為止,已發現Nrf2/ARE信號通路調控的可編碼內源性基因超過200個,其中,作為Nrf2/ARE信號路徑的主要調節蛋白,抗氧化酶類不僅能夠催化自由基轉化為無毒物質,還能加強其水溶性利于其排除,是機體維持氧化還原平衡的重要因素。γ-GCS就是機體內非常重要的受此通路編碼調節的一類抗氧化蛋白酶,γ-GCS是體內還原型谷胱甘肽(GSH)合成的限速酶,是一個由重鏈亞單位(γ-GCSh)和輕鏈亞單位(γ-GCSl)組成的二聚體。重鏈具有全酶的催化功能,輕鏈無催化活性,但對重鏈的活性起調節作用,機體內γ-GCS的含量和活性的升高,可以增強組織細胞抗氧化的能力。實驗中我們發現模型組Nrf2和γ-GCS蛋白表達水平明顯高于假手術組,說明急性脊髓損傷后的氧化應激損傷能夠導致Nrf2/ARE信號通路的激活,繼而上調γ-GCS的表達,共同參與到機體的抗氧化損傷防御。近年來姜黃素具有抗氧化作用已經受到人們的廣泛關注,研究表明:姜黃素不僅能夠激活多種抗氧化蛋白的表達,而且自身作為一種供氫體也是一種強有效的自由基清除劑,從而直接和間接地發揮其抗氧化作用。其對神經元的保護作用也在多項實驗中得到證實,但它的這些作用是否與上調Nrf2/ARE通路有關卻鮮有報道。本實驗中,我們觀察到CUR-L組和CUR-H組能夠明顯地上調Nrf2蛋白的表達,進而促進抗氧化蛋白酶γ-GCS的表達增強,而組織中MDA含量卻明顯降低,證明了姜黃素加強了脊髓損傷大鼠的抗氧化損傷能力。而且,通過對大鼠后肢功能評分和脊髓組織病理學檢查我們也可以發現,姜黃素能夠明顯改善脊髓損傷后大鼠的神經功能恢復情況,減輕脊髓組織的損傷程度。這提示在脊髓損傷早期就運用姜黃素進行抗氧化治療對疾病的預后是具有非常積極的影響的。姜黃素來源于姜科植物姜黃,而姜黃在中國和印度的傳統醫學中已被廣泛運用,療效肯定。而姜黃素作為姜黃的主要藥理成分,其多種藥理作用及安全性