乳酸桿菌腸道屏障的研究進展

腸道不僅是體內最大的消化部位，也是體內最大的免疫器官。這是防止腸道疾病入侵的第一個障礙。腸道屏障功能的好壞密切關系著動物的健康狀態和抗病能力。隨著抗生素在全球動物生產中的逐漸禁用,抗生素安全替代品在動物生產中得到了極大的推廣,其中乳酸桿菌對腸道屏障功能的保護作用也受到越來越多的關注。1乳酸桿菌的養殖乳酸菌(lacticacidbacterial,LAB)是指能利用碳水化合物產生大量乳酸的一類細菌的總稱。從形態上可分為桿狀和球狀兩大類,通常為革蘭氏陽性,接觸酶陰性,細胞色素陽性,厭氧或兼性厭氧,不運動,無芽孢。乳酸桿菌屬于乳桿菌科乳桿菌屬,無鞭毛,無莢膜,微需氧或厭氧,能夠分解糖類產生乳酸,具有較強的抗酸力,在pH3.0~4.5的酸性條件下仍能夠生存。乳酸桿菌營養需要包括氨基酸、多肽、核苷酸、維生素、無機鹽、脂肪酸和糖類等,最適pH為5~6,最適生長溫度為30~40℃。乳酸桿菌不僅是動物腸道內存在的正常微生物,也是益生菌的重要組成部分。在畜禽健康的情況下,乳酸桿菌可以通過生物頡頏作用,改善腸道微生物的生態環境,增強腸道上皮細胞的屏障層及提高動物的免疫功能等機制而發揮益生菌的作用。中國農業部1999年第105號公告公布的允許使用的飼料級微生物添加劑僅有12種:干酪乳桿菌、植物乳桿菌、糞鏈球菌、屎鏈球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、乳鏈球菌、啤酒酵母、產朊假絲酵母、沼澤紅假單胞菌(張日俊,2007)。中國正式批準生產的制劑中,對乳酸桿菌含菌數量與用量的規定是:其數量不少于107個/g,每日添加與用量的規定是:其數量不少于107個/g,每日添加0.1~3.0g,一般添加量為0.02%~0.20%(張日俊,2007)。但是,乳酸桿菌的缺點是耐熱性差,60~75℃條件下可被殺死,飼料制粒過程的瞬間高溫即可將其殺死而失效。2對腸道屏障的認識腸道屏障是指腸道能防止腸腔內的有毒物質(如病原菌和毒素等)穿過腸黏膜進入體內其他組織器官和血液循環的結構和功能的總和。正常的腸道屏障包括免疫屏障和非免疫屏障兩部分(Farhadi等,2003),其中免疫屏障主要指腸黏膜免疫系統,而非免疫屏障主要指腸黏膜屏障和微生物屏障。腸道屏障功能受損將導致腸道疾病的發生,如炎癥性腸病、壞死性腸炎和食物過敏等(Farhadi等,2003)。目前,監測腸道屏障功能的方法主要有測定腸道通透性、緊密連接蛋白的表達情況、血漿內毒素(LPS)含量、血漿中二胺氧化酶含量、血漿D-乳糖含量、腸道細菌易位、腸黏膜免疫細胞數量和抗體水平、防御素和黏蛋白的分泌量,以及促炎性細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6等)的水平等。2.1免疫調節作用腸道黏膜免疫系統是局部免疫系統的重要組成部分,它主要由腸相關淋巴組織(GALT)組成,包括組織化的淋巴組織和彌散型淋巴組織。其中組織化的淋巴組織是腸黏膜免疫系統的誘導位點和活化位點,主要負責攝取和轉運抗原,包括PP結、M細胞、腸系膜淋巴結(MLN)和孤立淋巴濾泡等。PP結是腸道黏膜免疫的主要誘導部位,具有攝取抗原、啟動免疫應答和調節IgA的產生等作用。M細胞是黏膜免疫的門戶,其主要功能是抗原攝取。彌散型淋巴組織是腸道黏膜免疫系統的效應位點,傳來的抗原在此被激活而產生抗體和各種免疫因子,主要指腸道黏膜固有層淋巴細胞(LPL)和上皮內淋巴細胞(IEL)。其中固有層是黏膜免疫應答的主要效應場所,參與免疫監視,對潛在的病原體作出積極的免疫應答反應,起到保護機體的作用,而IEL具有細胞殺傷和消除損傷上皮細胞的功能(Inagaki-Ohara等,2006),可調節細胞周轉和完整性,是免疫屏障的重要組成部分(Sanz等,2009)。此外,分泌型IgA作為腸黏膜應答的主要效應因子,給黏膜表面提供特殊的免疫屏障,是阻止病原體入侵和定植黏膜的第一道防線(Corthesy,2007),在維持黏膜穩態中起著非常重要的作用(Cerutti,2008)。在正常生理狀態下,腸道黏膜免疫系統處于大量抗原包圍中,并依賴嚴格的識別機制(如Toll樣受體通路等)來區分這些無害信號或危險信號(圖1)。對于無害信號刺激(日糧成分和共生菌等),GALT保持免疫耐受或低反應性的免疫監視狀態,以保障機體對營養物質的消化和吸收,維持腸黏膜的重要生理功能;對于危險信號(如病原菌等),GALT則及時反應將其清除,從而維持腸道穩定(Takahashi,2010)。2.2緊密連接蛋白腸黏膜物理屏障包括腸黏液層屏障和腸細胞屏障(圖2)。腸道黏液層主要由腸道杯狀細胞及腸上皮細胞分泌的黏液、漿細胞產生的分泌型IgA及黏液表面的大量水分組成的非攪動層組成(Farhadi等,2003)。腸黏液層屏障具有維持腸道的pH、阻止酸和蛋白酶及微生物對腸黏膜的侵蝕、潤滑腸道黏膜免受機械損傷,還可為正常菌群提供適宜的生存環境等重要作用。腸細胞屏障主要由腸上皮細胞及其間的緊密連接蛋白構成,它可阻止一些大分子物質的進入,而且腸上皮細胞更新速度快,從而減少了病原微生物在腸道內的定居。腸上皮細胞層主要由腸上皮細胞(占90%~95%)、分泌黏液的杯狀細胞、腸道內分泌細胞和分泌抗菌肽的潘氏細胞組成(Sanz等,2009)。緊密連接是相鄰上皮細胞間隙的松散連接,位于相鄰上皮細胞、間皮和內皮之間,多呈帶狀分布,少數為點狀,起著封閉細胞間隙的作用,可防止腸腔內物質自由經過細胞間隙(吳國豪,2004)。緊密連接對于維持選擇滲透性屏障功能非常關鍵,它通過調節限制穿過組織的離子與蛋白的運動,在細胞層間形成化學與離子梯度,從而有助于進行載體轉運過程(馬怡然等,2010)。正常情況下,緊密連接通過調控作用,選擇性地轉運相應物質,而有效地阻止腸腔內細菌、毒素及炎性介質等物質的旁細胞轉運,維持腸黏膜上皮屏障功能的完整(Nusrat等,2000)。緊密連接蛋白結構見圖3。目前,已知組成緊密連接的蛋白質包括跨膜蛋白(封閉蛋白occludin、閉合蛋白claudins)、JAM及胞質分子ZO-1、ZO-2、ZO-3、cingulin、7H6、rab3B、rab13、symplekin、AF-6等(Bazzoni等,2000)。跨膜蛋白與胞質分子的結構完整性及其之間的相互作用調節著緊密連接的屏障功能。2.3細菌和真菌生長腸道微生物是腸道微生態環境的重要組成部分。腸道免疫力的發育與腸道菌群密切相關(Blaschitz等,2010)。正常的腸道微生態群系是以腸道專性厭氧菌(如類桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等)為優勢菌的腸道菌群,它對病原菌的入侵起著屏障作用,并能協助動物產生免疫反應。雙歧桿菌或厭氧乳桿菌主要定植于腸道黏膜深層,類桿菌、消化鏈球菌和優桿菌定植在中層,表層定植需氧的大腸桿菌和腸球菌。動物體對致病菌或潛在致病菌定植和繁殖的抵抗力受宿主和腸道微生態群系的雙重影響,尤以正常菌群的影響最為重要。正常菌群作為自然生物屏障,是阻斷病原微生物定植和感染動物的關鍵步驟。腸道微生物區系的平衡對腸黏膜免疫系統的健康發展有重要作用。當腸道微生態發生失衡時,腸道抵御病原體的能力下降,主要表現為腹瀉、消化不良、腸炎等一系列腸道疾病。3蘑菇對腸道屏障的調節效果3.1細菌含zo益生大腸桿菌1917能夠上調小鼠IEC中ZO-1的表達量,從而防止DSS腸炎引起的黏膜通透性的增大,抑制腸腔抗原的進入(Ukena等,2007)。干酪乳桿菌增強了上皮通透性,增加了ZO-1的表達量,從而抑制了細胞因子TNF-α和IFN-γ誘導的IEC上皮屏障功能損傷,這可能是與MAPK信號通路和TLR2-PI3K/Akt通路有關(Eun等,2011)。乳酸菌對失血性休克小鼠腸道完整性的影響具有菌株特異性,其中鼠李糖乳桿菌顯著降低了小鼠的血漿內毒素水平、細菌易位情況及F-actin的分布,而植物乳桿菌對腸道完整性無顯著影響,但它們的DNA均能抑制由內毒素引起的TNF-α釋放,減輕腸炎癥狀(Luyer等,2005)。3.2菌rtec-1黏附于結腸的皮細胞早期研究結果表明,從兔的結腸黏膜中分離得到的黏蛋白可以抑制病原性大腸桿菌RDEC-1黏附于體外培養的結腸上皮細胞上(Mack等,1991)。植物乳桿菌299v和鼠李糖乳桿菌LGG可能通過提高腸黏蛋白MUC2和MUC3的表達,從而抑制病原菌黏附在腸上皮細胞上(Mack等,1999)。3.3植物乳桿菌對claudin3表達的調控體內和體外的試驗結果表明,益生菌VSL#3通過激活p38和ERK信號通路,提高了腸道緊密連接蛋白的mRNA表達量,從而保護腸道上皮屏障(Dai等,2012)。植物乳桿菌MB452顯著提高了體外培養的Caco-2細胞中19個與緊密連接蛋白相關的基因表達量,同時免疫熒光結果顯示植物乳桿菌處理10h后,Caco-2細胞的occludin、ZO-1、ZO-2和cingulin的熒光強度顯著高于對照組(Anderson等,2010)。鼠李糖乳桿菌LGG活菌或滅活菌均能誘導Claudin3表達上調,促進腸道屏障的成熟(Patel等,2011)。LGG降低了大腸桿菌O157∶H7感染導致的細胞形態變化、電阻力升高和腸道通透性減少,促進緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的重建(Johnson-Henry等,2008)。鼠李糖OLL2838抑制了TNF-α誘導的Caco-2細胞屏障損傷和IL-8分泌,且口服鼠李糖OLL2838活菌或滅活菌均能重建腸道屏障功能,這可能與腸上皮細胞的ZO-1及肌球蛋白輕鏈激酶的表達上升有關(Miyauchi等,2009)。3.4促進腸粘膜的免疫功能3.5抗炎性生物因子熱滅活短乳桿菌SBC8803能夠刺激熱應激蛋白和p38MAPK磷酸化,調節TNF-α、IL-1β和IL-12的蛋白表達量,增強氧化應激條件下的腸上皮屏障功能,維持腸道穩態,減輕腸道炎癥(Ueno等,2011)。LGG可能通過部分抑制NF-κB信號通路,減少促炎性細胞因子對腸上皮屏障完整性和腸道炎癥的影響(Donato等,2010)。嗜酸乳桿菌L-92能同時提高Th1和Th2細胞因子反應,誘導PP結產生TGF-β(Torii等,2007)。干酪乳桿菌亞種鼠李糖Lcr35處理48h后,顯著抑制了LPS誘導的Caco-2/PBMC(人外周血單核細胞)共培養體系中IL-8的含量,下調了單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的mRNA表達量,提高了電阻力,說明Lcr35在體外具有抗炎性作用,能夠改善沙門氏菌LPS誘導的腸道上皮炎癥引起的屏障損傷(Fang等,2010)。研究結果發現,干酪乳桿菌顯著減少了黏膜損傷面積、髓過氧化物酶(MPO)活性和細菌易位,改善了三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的黏膜損傷、炎癥反應和屏障損傷(Llopis等,2005)。3.6雞空腸大腸桿菌數、增加空腸乳酸桿菌數及大腸桿菌和乳酸桿菌比例在日糧中添加0.5%嗜酸乳桿菌(含菌量9×1010個/mL)顯著降低了肉仔雞空腸大腸桿菌數、增加空腸乳酸桿菌數及大腸桿菌和乳酸桿菌的比例(陳麗艷,2006)。食入的益生菌可能通過提高黏蛋白的表達,減少細菌過度生長,刺激黏膜免疫和合成抗氧化物質來增強黏膜屏障功能(Gotteland等,2001)。4乳酸桿菌制劑綜上所述,腸黏膜屏障、腸道免疫系統構成的免疫屏障及腸道菌群構成的生物屏障是腸道屏障的3大重要組成部分。隨著飼用抗生素的禁用后,乳酸桿菌制劑的研究和應用將是大勢所趨。許多研究結果表明,乳酸桿菌制劑對腸道屏障功能具有保護作用,能夠修復腸道炎癥和應激狀態下引起的屏障功能損傷。但是目前乳酸桿菌制劑的應用存在一些問題,如菌株特異性、生產工藝對其應用效果的影響、發揮最佳效應的添加方式和劑量、與益生元或其他添加劑的配伍問題等,仍有待進一步的研究。卷曲乳桿菌KT-11顯著提高了C3H/He