苦瓜水提多糖和苦瓜堿提多糖對sz誘導糖尿病小鼠降血糖作用的比較

許多國家和地區都有牙科藥物的記錄。全科苦堿具有較強的生理活性，尤其是種子和果實。它具有明顯的抗高血壓、腫瘤、殺素和流產等藥理作用。從苦瓜中已分離得到的降血糖成分包括三萜類、甾體類、蛋白多肽類等。但對其多糖的分離純化及其降糖活性的研究報道很少。本研究以苦瓜為原料，進行苦瓜多糖的分離與純化，并以STZ糖尿病模型小鼠為對象進行苦瓜多糖的降血糖活性研究，并初步探討其降糖機制。1材料和方法1.1血糖含量、測定試劑及儀器苦瓜，由揚中綠健苦瓜種植基地提供；鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司產品，用pH4.4的0.05mol/L檸檬酸緩沖液配制成10mg/ml的STZ溶液，4℃保存備用；胰島素放射免疫分析試劑盒，北京生物技術研究所產品；格列苯脲片（優降糖），天津市力生制藥廠；血糖試紙，美國強生公司；透析袋（3500u），德國進口分裝,（Da為dalton），其它試劑均為國產分析純。1.2動物昆明種小鼠，5～6w齡，體重20.4±2.2g，雌雄各半，江蘇大學醫學院實驗動物中心提供。1.3克氏原螯蝦sn-975型OneTouchUltra血糖儀，強生（上海）醫療器材有限公司；DMR顯微鏡，Leica，德國；SN-695型智能放免γ計數器，上海原子核研究所；電子天平，德國Startorius；紫外可見分光系統，美國瓦里安公司；LD5-2A離心機，北京醫用離心機廠；旋轉蒸發儀、真空干燥箱、恒溫水浴鍋等。1.4實驗方法1.4.1苦瓜多糖提取(1）原材料預處理：鮮苦瓜洗凈、去瓤、切成薄片，置真空干燥箱內脫水干燥，干燥箱內溫度控制在60℃以下。干燥的苦瓜經粉碎后，過40目篩，得苦瓜粉。稱取500g苦瓜粉，用1500ml95%乙醇、60℃回流提取2次，每次6h。濾液經蒸餾回收乙醇，殘渣風干后用于多糖提取。（2）提取：精稱經預處理的苦瓜粉100g，加2000ml蒸餾水，80℃、2h攪拌提取，重復3次，合并提取液；殘渣用1000ml蒸餾水（含5%NaOH）,4℃攪拌提取10h。分別得到苦瓜水提和堿提多糖液。提取液真空過濾，去除殘渣，得澄清液。再將澄清液于50℃真空濃縮，濃縮為原體積的五分之一，加入4倍提取液體積的95%乙醇溶液，冰箱放置過夜。（3）三氯乙酸法脫蛋白：沉淀用蒸餾水溶解，磁力攪拌機攪拌，使之充分復溶。在冰浴中緩緩加入25%三氯乙酸，直至溶液不再混濁。在低溫下（4℃）放置4h,4000r/min離心除去沉淀，稀堿中和。（4）透析：脫蛋白后的濃縮液用流動自來水透析72h，蒸餾水透析24h。透析液加4倍量95%乙醇沉淀，過夜，4000r/min離心15min。（5）真空干燥：得到淺黃色、粉狀水提和堿提苦瓜多糖粗品。1.4.2多糖中蛋白質及核酸的檢測(1）多糖的含量測定：采用改良的苯酚-硫酸法。（2）紫外-可見光譜分析：分別配成0.5mg/ml的水溶液，在波長為200～400nm之間掃描，觀察在280和260nm波長處有無吸收峰，確定多糖樣品中是否含有蛋白質或核酸。1.4.3stz-檸檬酸緩沖液的注射取小鼠50只，分為正常對照組和STZ誘導糖尿病模型組。STZ誘導糖尿病模型小鼠按照120、160、200、240mg/kgbw腹腔注射不同濃度的STZ-檸檬酸緩沖液0.5ml，正常對照組注射等量的生理鹽水。72h后斷尾取血，測定空腹血糖。每周測一次空腹血糖，連續3w，并記錄每組死亡率，篩選最佳STZ工作濃度。1.4.4小鼠血清學指標檢測取小鼠120只，隨機取出12只作正常對照（雌雄各半），其余按最佳STZ工作濃度腹腔注射STZ，正常對照組注射等量的生理鹽水，72h斷尾取血，測定空腹血糖，選取血糖≥11.1mmol/L的小鼠作為糖尿病模型小鼠。雌雄各半隨機分為5組，各組均常規飼養，自然光照，自由飲水。再進行如下處理：陽性治療組：灌胃格列苯脲，劑量為15mg/（kgbw·d）；苦瓜多糖處理組：給予300mg/(kgbw·d)；模型對照組和正常對照組灌胃等量生理鹽水。1/d，連續灌胃10d，禁食，次日晨眼眶取血，測定血糖及胰島素含量。小鼠血清胰島素水平檢測：以上各組小鼠，眼眶取血，室溫凝結2～3h，放入4℃冰箱過夜，3000r/min離心，吸出血清，分裝，保存于低溫冰箱中，用放射免疫法測定血清胰島素水平。以陰性組血糖值為正常對照，陽性血糖值為發病對照，比較格列苯脲及2種苦瓜多糖對糖尿病小鼠的降血糖效果。1.4.5小鼠胰腺boucn、s固定物的確定隨機取以上正常對照組小鼠，STZ模型對照組小鼠，血糖明顯下降的多糖處理組小鼠各2只，解剖取胰腺，PBS沖洗2次，分別固定于Boiun,s固定液并標記胰尾。固定24h后，取胰尾常規石蠟包埋，切片厚度9μm,HE染色，觀察胰島組織形態變化。1.5統計采用SPSSl0.0統計軟件方差檢驗，組間差異采用t檢驗。2結果與分析2.1提取、分離和提取苦葡萄糖苦瓜粉經乙醇回流，依次進行水提和堿提、醇沉、三氯乙酸法脫蛋白，透析，得到粗多糖MCW和MCB，得率分別為9.60%，7.32%。2.2mcb/mcb多糖吸收紫外-可見光譜分析表明，苦瓜多糖MCW和MCB在260和280nm處沒有吸收，說明它們不含蛋白，為純粹多糖。經苯酚-硫酸法檢測其糖含量分別為65.9%和70.3%。2.3多糖灌胃對小鼠血清胰島素水平的影響灌胃處理10d后，多糖處理組血糖水平均有顯著下降。MCW和MCB處理組比模型組分別降低了17.94%(P<0.05)和30.82%(P<0.01)。經不同的多糖灌胃處理后，STZ糖尿病對照組小鼠的血清胰島素水平均有一定的提高。苦瓜堿提多糖的效果優于水提多糖，與模型組相比，MCB處理組使小鼠血清胰島素水平上升了27.22%(P<0.01)。2.4小鼠胰島組織病理學檢測正常小鼠胰腺組織切片顯示胰島為圓形或橢圓形細胞團，細胞結構完整，排列規則，與周圍胰腺組織邊界清晰可辨，HE染色后比周圍胰腺組織著色較淺；STZ糖尿病對照組小鼠的胰島數量減少，胰島β細胞發生程度不等的細胞核凝縮，細胞破裂，局部區域出現組織壞死。與STZ糖尿病對照組小鼠相比，經多糖處理后，胰島部分組織仍可見炎癥浸潤，但未見明顯組織壞死（圖1）。3水提和堿提苦瓜多糖對stz大鼠空腹血糖的影響苦瓜具有確切的降糖生理活性，已知的主要降糖活性成分包括蛋白多肽、甾體和三萜以及豐富的鉻、鎂和鋅等元素，上述物質能參與人體糖代謝，與苦瓜的降血糖作用有關。此外，苦瓜中還含有其它未明確的降糖活性成分，如多糖類。然而關于苦瓜多糖的降糖活性相關報道很少，研究也不完善。從本實驗的結果可以看到，水提和堿提苦瓜多糖對STZ誘