桑樹總生物堿分析方法與提取方法的探討【摘要】目的研究桑樹總生物堿的分析方法和提取方法。方法采用理化反應(yīng)和薄層色譜對桑葉生物堿進(jìn)行定性定量分析。通過對桑樹生物堿成分的結(jié)構(gòu)特征的分析設(shè)計提取純化方法。結(jié)果發(fā)展了桑樹生物堿的薄層色譜方法，給出了從桑葉、桑椹、桑白皮和桑枝中提取總生物堿的方法。結(jié)論薄層色譜-可見分光光度法可用于桑樹總生物堿的定量分析，所提出的總生物堿提取方法具有可操作性。

【關(guān)鍵詞】桑樹；總生物堿；分析方法；提取方法

Abstract:ObjectiveTostudytheanalysisandextractionmethodsfortotalalkaloids(MTA)inreactionsandthin-layerchromatography(TLC)forqualitativeandquantitativeanalysiswereadopted,andmolecularstructuralcharacteristicsforextractionandpurificationschemedesignwerededuced.ResultsTLCmethodandextractionmethodofFoliumMori,FructusMori,CortexMoriandRamulusMoriweredeveloped.ConclusionMTAcanbedeterminedbyTLC-VISpreparationprocessofMTAinthisarticleispracticible.

Keywords:Mulberry;Totalalkaloids;Analysismethod;Extractionmethod

大多桑樹生物堿成分是野尻霉素(nojirimycin)的衍生物。野尻霉素最早于1965年從玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌R-468(StreptomycesroseochromogenesR-468)的發(fā)酵液中分得［1］，1966年被鑒定結(jié)構(gòu)［2］，1967年合成得到1,5-imino-1,5-didesoxy-D-glucit(即1-脫氧野尻霉素，1-deoxynojirimycin，DNJ)［3］。之后，1976年從桑樹(Morusspp.)中分得moranoline(即DNJ)［4］。由于nojirimycin,DNJ具有強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性［5，6］，因此桑樹中的這類哌啶生物堿衍生物一直備受重視。我國桑樹資源十分豐富，中藥桑葉、桑椹、桑白皮和桑枝均來源于桑樹。現(xiàn)在，人們已從桑類藥材中發(fā)現(xiàn)了多種哌啶生物堿，如表1所示，其中，DNJ是4味藥材的共有成分，研究也較多，大多數(shù)桑樹生物堿成分的結(jié)構(gòu)母核與其相同或類似，具有代表性，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。表1已發(fā)現(xiàn)的桑樹生物堿成分

從表1、圖1可以看出，哌啶型生物堿DNJ及其衍生物結(jié)構(gòu)中含有較多羥基，屬氮雜糖類，結(jié)構(gòu)中沒有苯環(huán)、雙鍵、羰基等發(fā)色團(tuán)，在可見光區(qū)和紫外光區(qū)都沒有吸收，因此定性定量分析都較困難。目前DNJ含量測定方法的思路主要有二，一是將DNJ進(jìn)行衍生，常用9-fluorenylmethylchloroformate(FMOC-Cl)，因FMOC-Cl有紫外吸收、亦有熒光，所以可用高效液色譜紫外檢測［14］或熒光檢測［15］或行測定；也可將DNJ乙酰化成為沸點(diǎn)較低的酯類，再采用氣相色譜法檢測［16］；二是無需衍生，用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測法(ELSD)直接測定［17］。顯然，這些方法不夠簡便、對儀器要求較高，而且，除非有多種生物堿的對照品，否則無法對總生物堿進(jìn)行測定。因此，尋找分析多羥基哌啶型生物堿的簡便方法十分必要。

關(guān)于哌啶生物堿單一成分如DNJ的提取、分析的報道較多，但桑類藥材總生物堿的分析方法和提取方法卻未見報道，本文對此進(jìn)行了探討。

1材料與儀器

桑葉總生物堿提取物為市售產(chǎn)品(DNJ含量50%)。桑葉、桑椹、桑白皮、桑枝藥材購于成都荷花池中藥材專業(yè)市場，經(jīng)鑒定為Morusalba的干燥葉、果、根皮和嫩枝。硅膠G、732陽離子交換樹脂(上海匯珠樹脂有限公司)、中性氧化鋁(成都市科龍化工試劑廠)、活性炭(成都市科龍化工試劑廠)，其余各種試劑為化學(xué)純或分析純。TU-1800紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

2方法與結(jié)果

桑樹總生物堿分析方法的研究實(shí)驗(yàn)中以桑葉總生物堿提取物為樣品進(jìn)行了分析方法的研究；后經(jīng)證實(shí)，桑椹、桑白皮和桑枝的總生物堿實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。

檢識反應(yīng)與生物堿沉淀試劑的反應(yīng)：取桑葉總生物堿提取物適量，加蒸餾水溶解，以鹽酸調(diào)pH2～3，過濾，所得溶液為淺黃色，取5份，分別與碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑、硅鎢酸試劑、磷鉬酸試劑、苦味酸試劑反應(yīng)，結(jié)果見表2。表2桑葉生物堿的檢識反應(yīng)

碘化鉍鉀、硅鎢酸、磷鉬酸與樣品呈陽性反應(yīng)，可用于定性鑒別。

亞硝酸反應(yīng)：考慮到DNJ屬于脂肪族仲胺，應(yīng)能與亞硝酸進(jìn)行反應(yīng)。試驗(yàn)時取上述桑葉總生物堿提取物的酸水溶液，置試管中，加入亞硝酸鈉水溶液，結(jié)果產(chǎn)生氣泡，持續(xù)時間近1h，隨著氣體的逸出，試管口顏色逐漸變深，幾乎呈褐色，而溶液的顏色則由淺黃色變?yōu)樯铧S色。

薄層色譜分析桑樹生物堿的薄層色譜分析鮮有報道，主要是由于DNJ及其類似物顯色困難。實(shí)驗(yàn)中取桑葉總生物堿提取物的水溶液，點(diǎn)樣于硅膠G板上，以醋酸乙酯-甲醇-冰醋酸(6∶2∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，顯色，檢識。曾實(shí)驗(yàn)碘化鉍鉀、磷鉬酸、碘蒸氣、10%硫酸-乙醇、α-萘酚、Enrilich試劑、苯胺-二苯胺-磷酸試劑、%高錳酸鉀等薄層色譜顯色劑，結(jié)果碘化鉍鉀顯色不明顯，其他試劑均未能顯色。

有文獻(xiàn)報道［18］，采用茚三酮試劑能使DNJ顯紫色斑點(diǎn)。經(jīng)試驗(yàn)，茚三酮能使樣品的薄層板顯出斑點(diǎn)，但是，用茚三酮顯色不能排出氨基酸的干擾，而亞硝酸反應(yīng)產(chǎn)生氣泡表明樣品中可能存在氨基酸。后終于找到氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑，能使樣品的薄層板顯紅黃色斑點(diǎn)。若令薄層板不顯色，刮取氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑能顯色的相應(yīng)位置的硅膠，以甲醇洗脫，洗脫液揮除溶劑，酸水溶解，加碘化鉍鉀試劑，結(jié)果呈陽性反應(yīng)，表明氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑能使桑葉生物堿顯色。又取谷氨酸水溶液，與桑葉總生物堿提取物平行試驗(yàn)，結(jié)果，氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑不能使谷氨酸顯色。因此，桑葉總生物堿用氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑顯色具有專屬性。氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑顯色的具體方法為：取少量高錳酸鉀置密閉容器中，加適量濃鹽酸令產(chǎn)生氯氣，將薄層板放入，15min后取出，置空氣中5min以上以除去氯氣，然后噴以鄰聯(lián)甲苯胺溶液(160mg鄰聯(lián)甲苯胺溶于30ml冰醋酸，加水至500ml，再加1g碘化鉀)，即可顯色。桑葉生物堿提取物的薄層色譜圖如圖2所示。

含量測定方法的提出實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桑葉生物堿經(jīng)氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑顯色后，在2h內(nèi)未見褪色，5h后慢慢褪色，顯色較為穩(wěn)定。刮取斑點(diǎn)，用甲醇洗脫，取洗脫液在200～800nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在209nm和446nm處有吸收峰，如圖3所示。后來發(fā)現(xiàn)，若樣品薄層色譜中有多個斑點(diǎn)，這些斑點(diǎn)的光譜圖基本一致。據(jù)此可提出含量測定方法：以DNJ為對照品，用薄層色譜-分光光度法進(jìn)行測定。

由于209nm屬于末端吸收峰，若用于含量測定則誤差較大，故宜選用446nm作測定波長。經(jīng)試驗(yàn)，甲醇洗脫液放置2h，446nm處的吸光度值基本不變，表明方法的耐用性良好。因此確定總生物堿的含量測定方法可采用薄層色譜-可見分光光度法。

另外，根據(jù)斑點(diǎn)顏色清晰、穩(wěn)定、以及不同斑點(diǎn)光譜圖基本一致的性質(zhì)，也可以考慮以DNJ為對照品，用薄層掃描法進(jìn)行含量測定。

桑樹總生物堿提取方法的研究本文桑樹總生物堿的提取、純化是建立在對結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的分析的基礎(chǔ)之上的。

根據(jù)桑樹生物堿的結(jié)構(gòu)推測其理化性質(zhì)

溶解性：由表1可知，DNJ類化合物為氮雜糖型結(jié)構(gòu)，羥基較多，極性較大，因此可溶于水、醇類溶劑，在氯仿等弱極性溶劑中、醋酸乙酯等中等極性溶劑中應(yīng)不能溶解或溶解度很小，因此，傳統(tǒng)的生物堿提取方法(酸水提取、氯仿萃取)將不適用，但可考慮用水、醇類溶劑提取。

堿性：由表1可知，桑樹生物堿多為脂肪族仲胺或叔胺，因此具有弱堿性，在一定pH條件下能成為離子狀態(tài)，故可以考慮用離子交換色譜進(jìn)行純化。另外，也以考慮使用氧化鋁等堿性吸附劑進(jìn)行分離。

水解性：對于氮雜糖本身而言，其化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，在酸、堿、熱作用下不易分解。但根據(jù)表1，不少生物堿成分以糖苷的形式存在，苷在酸性條件下尤其是加熱時易被水解，因此，提取分離中若使用酸時應(yīng)注意不能使作用時間太長，并應(yīng)盡量避免在酸性條件下加熱。

桑樹生物堿的提取工藝流程根據(jù)上述結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的分析，本文提出了以下的提取工藝流程。各提取步驟分別進(jìn)行沉淀反應(yīng)和薄層色譜跟蹤分析，以保證各工序所得到的成分為生物堿。

水提醇沉：取桑葉、桑椹、桑白皮、桑枝藥材，分別加水煎煮提取，煎液濃縮至一定體積，放冷后加乙醇使含醇量達(dá)70%，靜置過夜，濾取上清液，回收乙醇，得提取液。

離子交換樹脂富集：取上述提取液，適當(dāng)稀釋，用10%鹽酸調(diào)pH4～5，流經(jīng)已預(yù)處理的732陽離子交換樹脂柱，樹脂柱先以水洗至近中性，棄去水洗液，再用mol/L氨水洗脫，收集洗脫液，適當(dāng)濃縮。

正丁醇萃取：取上述濃縮液，以等量的水飽和的正丁醇萃取，共3～4次，分取正丁醇層，減壓回收溶劑，得正丁醇萃取物。

氧化鋁柱層析：取正丁醇萃取物，用少量水溶解，上樣于氧化鋁干柱，以乙醇洗脫，洗脫液回收乙醇，得氧化鋁純化物。

活性炭脫色：取氧化鋁純化物，以水溶解，加適量活性炭，煮沸15min，放冷，過濾，濾液濃縮除去溶劑，即得到總生物堿產(chǎn)品。

產(chǎn)品的初步分析

沉淀反應(yīng)：取上述產(chǎn)品，加水溶解，以鹽酸調(diào)pH2～3，分別加碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑、磷鉬酸試劑，結(jié)果4味藥的總生物堿均呈陽性反應(yīng)。

薄層色譜分析：薄層色譜條件同上。結(jié)果如圖4所示。

3討論

中藥有效成分的分析方法與提取方法建立的前提是對目標(biāo)成分理化性質(zhì)有充分的認(rèn)識。本文在分析桑樹生物堿結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出了桑樹總生物堿的新的定性定量方法和提取分離方法，方法可行性較好，但方法中的具體參數(shù)仍有待進(jìn)一步研究，所得總生物堿的含量尚待測定。

曾考慮采用酸性染料比色法進(jìn)行桑樹總生物堿的定量分析，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法干擾很大。

亞硝酸反應(yīng)中，有氣體產(chǎn)生，表明樣品應(yīng)存在含伯胺基的化合物，很有可能是氨基酸。后用谷氨酸進(jìn)行亞硝酸反應(yīng)，結(jié)果能產(chǎn)生大量氣體。

薄層色譜圖中，點(diǎn)樣原點(diǎn)亦明顯顯色，表明可能有部分生物堿成分停留在原點(diǎn)尚未展開，因此本文的薄層色譜條件尚需優(yōu)化。

氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑使桑樹生物堿顯色的原理可能是：新生態(tài)氯使生物堿氯代，然后氯代物與鄰聯(lián)甲苯胺發(fā)生縮合反應(yīng)生成聯(lián)苯醌而顯黃色［19］。

【參考文獻(xiàn)】

［1］NishikawaT,IshidaN.Anewantibiotic,R-468,activeagainstdrug-resistantShigella［J］.JAntibiotics,SerA,1965,18(3):132.

［2］InouyeS,TsuruokaT,NiidaT.Structureofnojirimycin,sugarantibioticwithnitrogeninthering［J］.JAntibiotics,SerA,1966,19(6):288.

［3］PaulsenH,SangsterI,HeynsK.MonosaccharidemitstickstoffhaltigemRing,XIII.SyntheseundReaktionenvonKeto-piperidinosen［J］.ChemBer,1967,100(3):802.

［4］YagiM,KounoT,AoyagiY,etal.Thestructureofmoranoline,apiperidinealkaloidfromMorusspecies［J］.NipponNogeikagakuKaishi,1976,50(11)：571.

［5］NiwaT,InouyeS,TsuruokaT,etal."Nojirimycin"asapotentinhibitorofglucosidase［J］.AgricBiolChem,1970,34(6)：966.

［6］FrommerW,MuellerL,SchmidtD，etal.Inhibitorsforalpha-glucosidases［P］.DE2658561,1978-06-29.

［7］KimuraM,ChenFJ,NakashimaN,etal.AntihyperglycemiceffectsofN-containingsugarsderivedfrommulberryleavesinstreptozocin-induceddiabeticmice［J］.WakanIyakugakuZasshi,1995,12(3)：214.

［8］ChenFJ,NakashimaN,KimuraI,etal.Potentiatingeffectsonpilocarpine-inducedsalivasecretion,byextractsandN-containingsugarsderivedfromMulberryleaves,instreptozocin-diabeticmice［J］.BiolPharmBull,1995,18(12)：1676.

［9］NaokiA,EmikoT,HaruhisaK,etal.SugarswithnitrogenintheringisolatedfromtheleavesofMorusbombycis［J］.CarbohydrRes,1994,253:235.

［10］AsanoN,YamashitaT,YasudaK,etal.Polyhydroxylatedalkaloidsisolatedfrommulberrytrees(MorusalbaL.)andsilkworms［J］.JAgricFoodChem,2001,49：4208.

［11］KusanoG,OriharaS,TsukamotoD,etal.FivenewnortropanealkaloidsandsixnewaminoacidsfromthefruitofMorusalbaLINNEgrowinginTurkey［J］.ChemPharmBull,2002,50(2)：185.

［12］AsanoN,OsekiK,TomiokaE,etal.N-containingsugarsfromMorusalbaandtheirglycosidaseinhibitoryactivities［J］.CarbohydrRes,1994,259：243.

［13］陳震，汪仁蕓，朱麗蓮，等.桑枝水提取物化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，2000，31(7):502.

［14］施新琴，崔為正，