實(shí)驗(yàn)2：分離以尿素為氮源的微生物2021/5/91尿素是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物，通常用作植物的氮肥。但是植物的根幾乎不吸收尿素，尿素經(jīng)微生物(脲酶)分解為氨,氨溶解于水中成為銨根離子而被植物吸收。一、基礎(chǔ)知識1、尿素(脲)：大量尿素的存在會對環(huán)境造成污染，如土壤板結(jié)、肥料利用率下降、地下水污染等。例如：2、選擇培養(yǎng)基：添加或減少某種成分，以允許某種微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中缺乏有機(jī)碳源時(shí)可篩選出自養(yǎng)型微生物只以尿素為氮源的培養(yǎng)基可篩選出含脲酶的微生物2021/5/92一、基礎(chǔ)知識3、玻璃砂漏斗：

玻璃砂(砂芯)漏斗有6種：

G1~G6(砂芯含有不同規(guī)格小孔)。G6孔徑最小，細(xì)菌不能濾過。若培養(yǎng)基中含有不能加熱滅菌的化合物，如尿素(加熱會分解)等，只能用G6玻璃砂漏斗過濾來除去微生物。

玻璃砂漏斗用前也要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(121℃，15min)。

用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽濾去酸，再用蒸餾水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。2021/5/93體積調(diào)節(jié)按紐吸頭脫卸按紐容量顯示窗吸頭(槍頭)套筒彈性吸嘴一、基礎(chǔ)知識4、移液器：移液器是一種在一定容量范圍內(nèi)可隨意調(diào)節(jié)的精密取液裝置（俗稱移液槍）。（1）結(jié)構(gòu)：（2）使用方法：2021/5/94各種規(guī)格吸頭各種規(guī)格移液器移液器的使用根據(jù)取用溶液體積選用適當(dāng)?shù)囊埔浩鞑僮鞣椒ǎ涸O(shè)定體積安裝吸頭吸液放液卸掉吸頭2021/5/95從大值調(diào)整到小值時(shí)，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)體積調(diào)節(jié)按紐到剛好即可。從小值調(diào)整到大值時(shí)，應(yīng)順時(shí)針先調(diào)至超過設(shè)定值后再回調(diào)。設(shè)定體積2021/5/96安裝吸頭將移液器頂端垂直插入吸頭，再輕輕用力下壓的同時(shí)，左右微微轉(zhuǎn)動，上緊即可。切記用力不能過猛，選擇與移液器匹配的吸頭。2021/5/97吸液1、預(yù)洗吸頭：吸取、排放樣液2~3次，讓吸頭內(nèi)壁形成一道

同質(zhì)液膜，確保移液工作的精度和準(zhǔn)度。一般液體，正向吸液(將按鈕按到第一檔釋放吸液)粘稠液體和易揮發(fā)液體，反相吸液(將按鈕直接按到第二檔吸液)2、垂直吸液、慢吸慢放：吸頭垂直浸入液面2-4mm。盡量避

免吸頭浸入液面過深，以免液壓對吸液的精確度造成影響。

吸液速度切記不能過快，以免導(dǎo)致液體吸入移液器內(nèi)部。將移液槍提離液面需停約1~3秒，觀察是否有液滴緩慢的流出。若有流出，說明有漏氣現(xiàn)象。2021/5/98放液吸頭緊貼容器壁放液。按鈕要待液體完全打出后再放松。正向：先將按鈕按至第一檔，略作停頓以后，再按至第二檔，這樣做可以確保吸液頭內(nèi)無殘留液體。反向：輕按按鈕至第一檔，排出液體。繼續(xù)按住按鈕，將

留在吸頭中的多余液體返回原來容器或隨吸頭丟棄。2021/5/99卸掉吸頭

一般用力下按吸頭脫卸按紐即可卸掉吸頭。

將吸頭丟棄到廢物收集器中。

移液器如不使用，將刻度調(diào)到最大量程，使彈簧

恢復(fù)原形，延長移液器的使用壽命。2021/5/910（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、使用專一的培養(yǎng)基（尿素為惟一氮源）分離專一的細(xì)菌（有脲酶的細(xì)菌）。2、使用指示劑（酚紅）顏色的變化檢知酶（脲酶）所催化的反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容是：用尿素固體培養(yǎng)基從土壤中分離出能利用尿素的細(xì)菌，觀察菌落數(shù)；并以LB全營養(yǎng)固體培養(yǎng)基為對照，觀察全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容比較兩者的菌落數(shù)，可知能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中所占的比例2021/5/911（二）實(shí)驗(yàn)原理：

在土壤中，存在一些細(xì)菌，它們含有脲酶，能分解尿素(脲)作為其生長的氮源(NH3)1.利用尿素培養(yǎng)基(以尿素為惟一氮源的選擇培養(yǎng)基)，分離出土壤中含脲酶的細(xì)菌。2CO32NH2OH+????+脲酶22)(ONH=C二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2.細(xì)菌合成的脲酶能將尿素分解成NH3，致使PH升高，使酚紅指示劑變紅。2021/5/912二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（三）設(shè)備及用品：略（四）材料2、全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母提取物、NaCl、瓊脂糖、水。3、尿素固體培養(yǎng)基：葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚紅、

瓊脂糖、水、尿素。1、100mL燒杯：裝有50mL70%酒精，浸泡著玻璃刮刀6、土樣：從有哺乳動物排泄物的地方取（糞便中含尿素，利于含脲酶的微生物生長）4、5支有塞試管：盛有4.5mL蒸餾水5、250mL三角瓶：盛有90mL蒸餾水2021/5/913為什么要設(shè)置全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基？起對照作用。土壤中含有多種細(xì)菌，在全營養(yǎng)LB培養(yǎng)基中，多數(shù)細(xì)菌都能生長；而在僅以尿素為氮源的培養(yǎng)基中，只有含有脲酶的微生物才能生長。1、為什么用瓊脂糖替代瓊脂作為固化劑？酚紅在此起什么作用？

瓊脂是末被純化的混合物，內(nèi)含有一定量的含氮化合物。如果用瓊脂固化培養(yǎng)基，會為細(xì)菌提供一定量的非尿素類氮源，這樣會在尿素固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量以非尿素為氮源的細(xì)菌，不利于以尿素為氮源的細(xì)菌的篩選。

酚紅為酸堿指示劑，在酸性環(huán)境呈黃色，在堿性環(huán)境呈紅色。通過酚紅的顏色變化，可檢測培養(yǎng)基中pH的變化。思考與練習(xí)：2021/5/914注意：取樣時(shí)盡量只取懸液。稱量—溶化—調(diào)PH—分裝—加塞封口—包扎—滅菌二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（五）實(shí)驗(yàn)步驟：1、配制培養(yǎng)基并滅菌2、倒平板3、制備細(xì)菌懸液4、用涂布分離法分離細(xì)菌5、細(xì)菌培養(yǎng)6、觀察、對比全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基(除尿素外)均進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；尿素固體培養(yǎng)基待冷卻到60℃，加入用G6玻璃漏斗過濾的尿素溶液。用10-4和10-5的土壤稀釋液各濃度均做三個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)，37℃24~48h。實(shí)驗(yàn)組與對照組菌落數(shù)制成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀釋液用移液器取0.1ml土壤稀釋液用涂布器涂布分離2021/5/915二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（六）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：10-4、10-5土壤稀釋液尿素培養(yǎng)基上涂布結(jié)果10-4、10-5土壤稀釋液全營養(yǎng)LB培養(yǎng)基上涂布結(jié)果

這說明能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中只占少數(shù)。因?yàn)槿撕推渌溉閯游锂a(chǎn)生的排泄物畢竟是少量的，且尿素還可以在高溫下自然分解，因此，以尿素為氮源的菌群較少。4、與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)相比，為什么尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落？思考與練習(xí)：2021/5/9162.有脲酶的細(xì)菌在生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定上起什么作用？3.有脲酶的細(xì)菌菌落周圍為什么有著色的環(huán)帶出現(xiàn)？

土壤中大量尿素的存在會對環(huán)境造成污染，如土壤板結(jié)、肥料利用率下降、地下水污染等。

有脲酶的細(xì)菌能分解尿素，并利用所形成的氨，有利于自然界中的氮循環(huán)。

有脲酶的細(xì)菌向胞外分泌脲酶，使培養(yǎng)基中的尿素(中性)分解產(chǎn)生氨(堿性)，導(dǎo)致培養(yǎng)基中酚紅指示劑變?yōu)榧t色。培養(yǎng)基中酸堿指示劑產(chǎn)生顏色變化(變紅)，標(biāo)志著存在脲酶分解尿素的作用，從而證明該菌株可以以尿素為氮源。紅色環(huán)狀區(qū)域的大小代表脲酶活性的強(qiáng)弱和含量的多少。紅色區(qū)域越大，表明菌株利用尿素的能力越強(qiáng)。思考與練習(xí)：2021/5/917本實(shí)驗(yàn)的微生物分