綠色木霉菌發酵液的抑菌活性及穩定性研究

木霉廣泛存在于土壤中，其作用譜廣泛，作用機制多樣。它經常被用來預防和處理農業土壤細菌疾病。綠色木霉是木霉科的一個重要經濟意義。目前，它對工業、農業和環境科學有了廣泛的應用。綠色木霉可以產生分解或不分解的抗生素，如木霉素、膠原、細菌和發芽酶。目前，對綠色木霉的研究主要集中在對代謝酶的提取和使用上，對綠色木霉發芽液的抗菌活性和穩定性的研究較少。作者在植物科中檢測了幾種致病性細菌和細菌的抗菌活性及其不同條件下的穩定性，并為綠色木霉發芽液在蔬菜新鮮等領域的應用提供了參考。1材料和方法1.1細菌、真菌和黑曲霉綠色木霉菌(Trichodermaviride),荔枝炭疽菌(Colletotrichumsp.),尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum),灰綠青霉(Penicilliumglaucum),芒果膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.),根霉(Rhizopussp.),黑曲霉(Aspergillusniger),購于廣東省微生物研究所.沙門氏菌(Salmonella),金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus),大腸桿菌(Escherichiacoli),宋內志賀菌(Shigellasonnei),銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),由廣東省疾病預防中心提供.1.2調ph測定綠色木霉菌液態發酵用培養基按如下配方配制:土豆20g、葡萄糖2g、玉米粉1g、聚山梨酯0.1g,蒸餾水100mL,調pH至9,121℃高壓滅菌后分裝備用.1.3綠色木霉菌懸液的發酵將綠色木霉菌活化培養72h,加10mL無菌蒸餾水制成菌懸液,備用.取250mL錐形瓶數只,分別裝入60mL液體培養基、150μL綠色木霉菌懸液,置32.5℃、120r/min的恒溫搖床發酵7d.1.4菌落抑菌率測定以抑菌率作為綠色木霉菌發酵液對真菌的抑菌活性指標.各取綠色木霉菌發酵液2mL于無菌培養皿內,與18mL冷卻至45℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基混勻,冷卻后在培養基表面分別放入荔枝炭疽菌、尖孢鐮刀菌、灰綠青霉、芒果膠孢炭疽菌、根霉和黑曲霉的菌餅,28℃培養24h.以無菌蒸餾水處理作為對照,各重復3次.采用十字交叉發測定菌落直徑,取平均值計算抑菌率.抑菌率計算公式如下:Ri=Di?diDi×100%Ri=Di-diDi×100%其中Di為空白對照培養基中菌落直徑的平均值;di為在添加綠色木霉菌發酵液的培養基中菌落直徑的平均值.對細菌的抑菌試驗采用牛津杯法測定發酵液對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、宋內志賀菌和銅綠假單胞菌抑菌圈的直徑,以無菌蒸餾水作對照,各重復3次,以抑菌圈的平均直徑作為判斷綠色木霉菌發酵液對細菌的抑菌活性指標.1.5發酵溶液的抗菌穩定性1.5.1抑菌率測定分別將發酵液置于室溫、40、50、60、70、80、90和100℃恒溫水浴鍋中處理40min,于4℃冰箱放置12h,測其對荔枝炭疽菌、尖孢鐮刀菌的抑菌率,各重復3次.1.5.2白砂糖的抑菌效果測定用0.1mol/LHCl和0.1mol/LNaOH分別將發酵液的pH調至3、4、5、6、7、8、9和10,于4℃冰箱放置12h,測定其對荔枝炭疽菌、尖孢鐮刀菌的抑菌率,各重復3次.1.5.3抑菌率測定分別將發酵液置于4℃下儲藏0、8、17、27、46和64d,測定其對荔枝炭疽菌的抑菌率.分別以置于室溫、避光條件下的發酵液和置于室溫、自然光條件下的發酵液為對照,各重復3次.1.5.4微波抑菌率測定分別將發酵液置于功率調至800W的微波爐中處理0、10、30、60、120和300s,測定其對荔枝炭疽菌、尖孢鐮刀菌的抑菌率,各重復3次.1.5.5陽離子檢測抑菌率分別配制0.1mol/L的K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+和Fe3+的離子溶液,與發酵液按1∶9的體積比混合,于4℃冰箱放置15h,然后測定其對荔枝炭疽菌的抑菌率,各重復3次.1.5.6苯甲酸鈉、丙酸鈣溶液的抑菌效果分別配制0、0.01、0.03、0.05、0.08和0.12mol/L的苯甲酸鈉和丙酸鈣溶液,與發酵液按1∶9的體積比混合,于4℃冰箱放置15h,然后測定其對荔枝炭疽菌、尖孢鐮刀菌的抑菌率,各重復3次.1.5.7抑菌性的測定分別配制0、0.5、1、2、4和8g/L的維生素C溶液以及0、0.01、0.03、0.05、0.08和0.12mol/L的亞硫酸鈉溶液,與發酵液按1∶9的體積比混合,于4℃冰箱放置15h,然后測定其對荔枝炭疽菌、尖孢鐮刀菌的抑菌率,各重復3次.1.5.8雙氧水反應率、雙氧水比、水比、回復突變率表1分別配制體積分數0%、0.1%、0.3%、0.5%和1.2%的雙氧水,與發酵液按1∶9的體積比混合,于4℃冰箱放置15h,然后測定其對荔枝炭疽菌、尖孢鐮刀菌的抑菌率,各重復3次.2結果與分析2.1發酵溶液的抗菌作用2.1.1果膠孢炭疽菌、合成菌株和根霉綠色木霉菌發酵液對真菌有較高的抑菌活性,其中對芒果膠孢炭疽菌的抑制作用最強,其次是荔枝炭疽菌﹑尖包鐮刀菌和根霉,抑菌率均超過50%;而對黑曲霉和灰緣青霉菌的抑制作用稍弱,抑菌率在50%以下(表1).2.1.2菌種抑菌效果綠色木霉菌發酵液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強,抑菌圈直徑分別為37.33和34.00mm,而對沙門氏菌、宋內志賀菌、大腸桿菌的抑菌效果比較弱(表2).2.2發酵溶液的抗菌穩定性2.2.1溫處理前后活性炭刀菌抑菌率的變化綠色木霉菌發酵液的熱穩定性較高(圖1),經80℃加溫處理后對荔枝炭疽菌、尖孢鐮刀菌抑菌率仍能保持在60%以上,與未經過加溫處理的發酵液相比,抑菌率降低均在8%以內;而經80℃以上的加溫處理后,抑菌率急劇下降.2.2.2堿性穩定性在pH在5~8范圍內,綠色木霉菌發酵液能保持其活性(圖2).過酸或過堿均對其活性有影響.2.2.3抑菌率和儲藏時間對監管的影響綠色木霉菌發酵液在4℃避光條件下儲藏,對荔枝炭疽菌的抑菌率隨時間的延長而下降緩慢,且始終保持在50%以上,而常溫條件下儲藏抑菌率隨時間的延長而下降較快(圖3).2.2.4微波穩定性短時間的微波處理對綠色木霉菌發酵液抑菌活性的穩定性影響不大,300s內其對荔枝炭疽菌的抑菌率僅下降約7%(圖4).2.2.5cu2+與fe3+對不同菌株枝炭疽菌抑菌效果的影響K+、Na+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+處理的和未處理的綠色木霉菌發酵液對荔枝炭疽菌的抑菌率分別為69.18%、71.06%、72.93%、69.18%、61.31%、68.38%、57.10%和71.48%,說明Cu2+與Fe3+對綠色木霉菌發酵液的抑菌效果影響較大,使其對荔枝炭疽菌的抑菌率分別下降了約10%和15%;而K+、Na+、Zn2+、Mg2+和Fe2+對抑菌率影響較小,下降幅度在4%以內.2.2.6不同濃度丙酸鈣對綠色木霉菌發酵液抑菌效果的影響在0~0.12mol/L苯甲酸鈉處理時,隨濃度增大綠色木霉菌發酵液的抑菌效果呈緩慢下降的趨勢(圖5).0~0.12mol/L丙酸鈣處理對綠色木霉菌發酵液的抑菌效果影響不明顯(圖6).2.2.7維生素c處理對綠色木霉菌發酵液的抑菌活性影響在0~0.12mol/L亞硫酸鈉處理時,隨濃度增大綠色木霉菌發酵液的抑菌率呈逐漸下降的趨勢,當濃度低于0.05mol/L時,綠色木霉菌發酵液的抑菌活性較高的穩定性,抑菌率維持在50%以上(圖7).0~8g/L維生素C處理對綠色木霉菌發酵液的抑菌效果影響不大,抑菌率均高于50%(圖8).2.2.8種樹莓汁抑菌率的變化在體積分數低于0.5%的H2O2處理時,綠色木霉菌發酵液具有較高的穩定性,而當H2O2體積分數大于0.5%時抑菌率開始下降(圖9).3微波處理對綠色木霉菌發酵液的抑菌活性影響綠色木霉菌發酵液對真菌和細菌均具有較強的抑菌活性.在對真菌的試驗中,發酵液對芒果膠孢炭疽菌的抑菌效果最強,抑菌率高達75.18%;在對細菌的抑菌試驗中,發酵液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強,抑菌圈直徑分別為37.33和34.00mm.據王勇等報道,綠色木霉菌發酵液對真菌的抑制機理是由于發酵液中的幾丁質酶破壞了真菌的細胞壁,真菌的保護屏障消失,導致真菌生長受阻和死亡.綠色木霉菌發酵液對細菌的作用未見報道,其機理可能與干擾細胞壁合成、損傷胞漿膜、影響細胞蛋白合成、影響核酸合成、干擾遺傳密碼復制等有關.抑菌穩定性試驗中,綠色木霉菌發酵液表現出了較高的熱穩定性,在80℃以下的溫度處理后其對真菌的抑菌率仍能保持在60%以上.因此,為了有效地保持綠色木霉菌發酵液的抑菌活性,其處理溫度不宜超過80℃.在pH5~8范圍內,綠色木霉菌發酵液能保持其活性,這可能與綠色木霉菌發酵液中幾丁質酶的活性有關,幾丁質酶在該pH范圍內活性較強.綠色木霉菌發酵液在低溫(4