靈芝多糖還原能力的研究

在生物生命活動的氧化代謝過程中，會產生各種自由基。自由基不僅是生物體多種生理功能的啟動因素和生化反應的介導者,同時也在免疫細胞因子網絡中起調節、信號轉導作用。現代生命科學、醫學研究表明,隨著年齡的增長,人類機體內自由基的自穩態平衡性下降,從而導致自身免疫功能下降,發生腫瘤、動脈粥樣硬化、原發性高血壓、Alzheimer型早老性癡呆等自由基疾病。靈芝(Ganodermalucidum)在我國自古就有“仙草”的美譽,已有悠久的藥用和食用歷史,《神農本草經》、《本草綱目》中都有靈芝的藥效記載。多糖是靈芝中的主要活性組分之一。20世紀70年代以來,靈芝多糖的研究開發進入了一個嶄新的發展時期,經過近30年的發展,人們對靈芝多糖這一重要生命物質產生了新的認識。據報道,從雙孢蘑菇、靈芝、香菇、側耳等6種真菌中提取出的活性成分,可以防止細胞內DNA的氧化損傷。劉志峰等研究證明,蘑菇提取物對脂質過氧化的抑制率可達29%。真菌提取物對自由基有一定的清除作用。真菌是自由基清除劑的良好載體。而多糖是真菌中的主要活性成分。目前,國內外基本上采用水浸法、堿浸法提取多糖,再經有機溶劑沉淀提純。由于傳統工藝采用堿浸、有機溶劑分離提純等手段,易對靈芝多糖聚合體造成破壞,也易造成某些活性基團變性失活,且粗多糖提取效率極低。膜分離技術是近年來發展起來的在分子水平上實現機械分離的高新技術,由于其具有常溫操作、無相態變化、高效節能、無污染等特點,且整個分離過程在密閉系統中進行,可避免和減輕熱和氧對物料營養成分的破壞,因此,被認為是21世紀最有前途的技術。采用膜技術進行靈芝多糖的分離純化,不僅收率高而且極少破壞靈芝多糖結構。作者在此對靈芝多糖的還原能力及其對羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(·O2-)的清除活性進行了研究探討,并對不同工藝制取的靈芝多糖的清除自由基的能力進行了比較。1實驗1.1材料、試劑和機器靈芝,天津市林業果樹研究所。鄰苯三酚、番紅花T、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等,均為分析純。恒溫水浴箱,752型分光光度計。1.2提取靈芝河谷葡萄糖靈芝子實體→粉碎→粗濾→真空濃縮→醇沉→干燥(2)膜分離工藝靈芝子實體→粉碎→預煮→粗濾→微濾→超濾→濃縮干燥1.3性能試驗1.3.1波長對研究內容的影響在2.5mLpH值6.6的磷酸緩沖溶液中加入1mL樣品、2.5mL1%鐵氰化鉀,混合物在50℃恒溫條件下加熱20min,急速冷卻,加2.5mL10%三氯乙酸,3000r·min-1離心分離,取上層清液2.5mL,加2.5mL水,再加0.5mL0.1%FeCl3,混合均勻,靜置10min后在波長700nm下測吸光度A700。A700值越大,則樣品的還原能力越強。1.3.2硫酸鈉鹽緩沖溶液體系中od值的測定·OH可使番紅花T褪色,即在520nm處可測出·OH的生成情況,進而檢測出加入樣品的抗氧化活性。反應體系終體積4.5mL,其中含150mmol·L-1硫酸鈉鹽緩沖溶液(pH值7.4)、114μmol·L-1番紅花T、1.927mmol·L-1EDTA·Na2、1.0mmol·L-1硫酸亞鐵、3%H2O2以及不同濃度的樣品,在37℃恒溫水浴30min后,加入0.3mmol·L-1EDTA·Na2終止反應,以緩沖溶液作參比,在520nm處檢測其OD值。空白組以0.1mL蒸餾水替代樣品,對照組以1.5mL蒸餾水替代樣品和EDTA·Na2。按式(1)計算清除率:1.3.3中間物生成量的測定根據吳慧平的方法,鄰苯三酚在堿性條件下能發生自氧化生成有色中間物(在420nm處有最大吸收峰)和·O2-,·O2-對自氧化又起催化作用,依據有色中間物的生成量,可判斷·O2-的生成量。實驗體系為3mLTris-HCl緩沖溶液(pH值8.2)和0.1mL不同濃度的樣品,25℃水浴20min后加入3mL濃度為7mmol·L-1的鄰苯三酚,反應4min后加入10mol·L-1的HCl終止反應,以Tris-HCl緩沖溶液作參比,在420nm處測OD值。對照組以0.1mL蒸餾水替代樣品,空白組為不加鄰苯三酚。按式(2)計算清除率,根據清除率判斷樣品對·O2-生成的影響。2結果與討論2.1還原能力的測定鐵氰化鉀還原法的原理為:在波長700nm條件下測定吸光度A700,結果見表1。由表1可知,0.10mg·mL-1靈芝多糖溶液的A700值與水體系A700值相當,說明該濃度(均指加入反應體系的樣品起始濃度,下同)下靈芝多糖沒有還原能力。隨著濃度的增大,A700值也增大,多糖的還原能力在實驗濃度范圍內有較好的量效關系。以30μg·mL-1Vc溶液的還原能力作參比,1.00mg·mL-1多糖溶液的還原能力強于Vc。以相同起始樣品濃度比較A700值,靈芝多糖還原能力明顯低于Vc的還原能力,但靈芝多糖溶液還原能力的存在說明靈芝多糖具有抗氧化作用的可能性。2.2脂質過氧化法多糖可以捕捉脂質過氧化鏈式反應中產生的活性氧,減小脂質過氧化反應鏈的長度,阻斷或減緩脂質過氧化的進行。對于·OH而言,可快速攫取多糖碳氫鏈上的氫原子結合成水,而多糖的碳原子上則留下一個成單電子,成為碳自由基,進一步氧化形成過氧自由基,最后分解成對機體無害的產物;對于·O2-,多糖可與其發生氧化反應,達到清除的目的。2.2.1羥自由基清除率由表2可知,隨著靈芝多糖濃度的增加,對Fenton反應體系產生的羥自由基的清除率相應增大,且量效關系非常明顯。在相同濃度下,膜分離工藝提取的靈芝多糖清除羥自由基的能力強于傳統的水提醇沉工藝,IC50分別為1.36mg·mL-1、1.58mg·mL-1。2.2.2膜分離工藝提取的牛蒡多糖超氧陰離子自由基的能力由表3可知,隨著靈芝多糖濃度的增加,對鄰苯三酚自氧化體系產生的超氧陰離子自由基的清除率相應增大,且量效關系非常明顯。在相同濃度下,膜分離工藝提取的靈芝多糖清除超氧陰離子自由基的能力強于傳統的水提醇沉工藝,IC50分別為2.55mg·mL-1、2.83mg·mL-1。綜上所述,膜分離工藝提取的靈芝多糖清除自由基的能力強于傳統水提醇沉工藝。這是因為,在靈芝多糖的提取過程中,傳統工藝采用了有機溶劑和多次高溫處理,使多糖的生物活性受到影響。3不同工藝提取的巖溶多糖的抗氧化能力(1)靈芝多糖濃度在0.10mg·mL-1時,其A700值與水體系相當,沒有還原能力;在1.00mg·mL-1時,多糖溶液的還原能力強于30μg·mL-1的Vc溶液;以相同起始樣品濃度比較A700值,靈芝多糖還原能力明顯低于Vc的還原能力。但靈芝多糖溶液還原能力的存在說明靈芝多糖具有